陳 煒 趙建文 張智俊 林新春 郭小勤,2,*

(1 浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300；2 浙江省竹資源與高效利用協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 311300)

油菜素內(nèi)酯(brassinosteroids, BRs)是繼生長素、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸和乙烯之后發(fā)現(xiàn)的第六大類植物激素,參與調(diào)控植物多種生長過程[1-2]，如根的生長[3]、莖的伸長[4]、葉的伸展[5]、微管系統(tǒng)的發(fā)育[6]、植物在黑暗條件下的形態(tài)建成[7]、花粉管的生長[8]、種子的發(fā)育[9-10]等。研究表明，擬南芥(Arabidopsisthaliana)CYP85A1/A2基因編碼的蛋白均屬于細胞色素P450超家族的一員[11-12],參與BRs合成中重要的催化反應(yīng)步驟，包括6-脫氧茶甾酮氧化為茶甾酮、3-脫氫-6-脫氧茶甾酮氧化為3-脫氫茶甾酮、6-脫氧香蒲甾醇氧化為香蒲甾醇及6-脫氧油菜素甾酮氧化為油菜素甾酮。CYP85A1/A2基因的突變體表現(xiàn)出明顯的矮化表型[13]，水稻(OryzasativaL.)的BR突變體也表現(xiàn)出莖稈和葉伸長缺陷表型[14]。番茄(Solanumlycopersicum)中該基因的突變體也表現(xiàn)出明顯的矮化表型，且該突變體果實的產(chǎn)量顯著下降[15]。

竹子屬禾本科(Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)多年生常綠單子葉植物，不同竹種均可在短時間內(nèi)完成高生長，據(jù)報道毛竹(Phyllostachysedulis)日生長量可達119 cm[16]。但目前尚未有竹類植物的快速生長與CYP85A1基因的相關(guān)性的報道。本研究以20種不同株高和節(jié)間長度的竹類植物為試驗材料，分別獲得20個CYP85A1的同源基因，分析該基因的序列并檢測其表達量，以期明確CYP85A1基因與竹類植物節(jié)間伸長間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

選取竹亞科20個(表1)竹種進行試驗，所選取的竹種均來自浙江農(nóng)林大學翠竹園和太湖源，分別采集不同竹種的葉片約5 g，并立即用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.1 組織特異性表達分析 以同時出土的孝順竹和鳳尾竹為材料，待孝順竹幼竹長至5 m時(幼竹還未長葉)，采集幼竹第2節(jié)間、最長節(jié)間(第4或第5節(jié)間)和頂部以及母竹根、莖、葉和側(cè)枝4個組織。同時待鳳尾竹幼竹長至1 m時(幼竹還未長葉)，采集幼竹第2節(jié)間、最長節(jié)間(第4或第5節(jié)間)和頂部以及母竹根、莖、葉和側(cè)枝4個組織。每樣本設(shè)3次生物學重復。

1.1.2 發(fā)育階段表達分析 分別取1、3、5、7 m的孝順竹的第2節(jié)間、最長節(jié)間(第4或第5節(jié))和頂部組織，同時取0.3、1、1.8 m的鳳尾竹的第2節(jié)間、最長節(jié)間(第4或第5節(jié))和頂部組織。每樣本設(shè)3次生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA和RNA提取、引物設(shè)計、PCR擴增、序列測定 分別選取樣本葉片各2 g，用液氮研磨至粉末，采用CTAB法[17]提取樣品總DNA；利用Trizol法[18]提取樣品總RNA；按照TaKaRa(日本)公司生產(chǎn)的PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用ClonExpress?快速克隆技術(shù)進行引物設(shè)計和序列擴增。以水稻CYP85A1基因為目標序列，搜索毛竹基因組數(shù)據(jù)庫，獲得毛竹CYP85A1基因序列(PH01000278)。以此為基準序列，用CE Design V1.03軟件進行引物設(shè)計。上游引物為5′-ATGGTGCTCCTAGTGGCGATC-3′，下游引物為5′-CTATGTGAGTATCCTATCTAAACTCAGCAA-3′。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括1 μL模板DNA，上、下游引物各0.5 μL，GreenTaqMix 30 μL，加ddH2O補足至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸3 min，32個循環(huán)；72℃延伸 10 min。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓 150 V，電泳20 min。對瓊脂糖凝膠電泳分離后的目的片段確認拍照，割膠回收擴增的目的基因片段，用Vazyme(南京)公司生產(chǎn)的ClonExpress?Entry One Step Cloning Kit試劑盒進行重組連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后獲得陽性克隆送至上海生工生物公司測序。

1.2.2 生物信息學分析 對所獲得的序列進行BLAST比對, 采用DNAMAN軟件進行序列比對和氨基酸序列的翻譯,分析20個竹種基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域。采用ExPASy的Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)進行CYP85A1蛋白的氨基酸殘基組成、分子質(zhì)量、親/疏水性及等電點的在線分析。采用PRABI的SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測。采用ExPASy的Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/interactive)進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測[19]。

1.2.3CYP85A基因家族聚類分析 采用Mega 6對不同物種的CYP85A基因家族氨基酸序列構(gòu)建進化樹，進化樹生成算法采用鄰接(Neighbor-joining，NJ)法，利用Bootstrap對進化樹進行驗證，重復次數(shù)設(shè)置為1 000。

1.2.4CYP85A1基因表達分析 采用實時熒光定量PCR檢測目的基因在孝順竹和鳳尾竹中的表達量。提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將此cDNA模板稀釋10倍，作為實時熒光定量PCR模板。采用Primer Premier 5軟件設(shè)計PCR引物，以cDNA為模板進行PCR驗證引物是否合適。然后按照TaKaRa(日本)公司生產(chǎn)的SYBR? Premix ExTaqTMⅡ試劑盒說明書進行熒光定量分析，上游引物5′-AGCAGCAAGGGAGGAGGA-3′，下游引物5′-AGGAACTCGGTGGTCTCG-3′,NTB為內(nèi)參基因[20]，其上游引物為5′-TCTTGTTTGACACCGA AGAGGAG-3′，下游引物為5′-AATAGCTGTCCC TGGAGGAGTTT-3′。熒光定量PCR反應(yīng)體系為15 μL，其中含0.75 μL模板，上、下游引物各0.6 μL，SYBR Premix ExTaqTMⅡ 7.5 μL，加ddH2O補足至15 μL。實時熒光定量PCR反應(yīng)程序：95℃預變性30 s; 95℃變性5 s，55℃退火30 s，共40個循環(huán)，每個擴增反應(yīng)重復3次。采用2-ΔΔCt法[20]計算目的基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 20個竹種CYP85A1基因擴增和序列分析

以毛竹數(shù)據(jù)庫中下載的毛竹全基因組序列、cDNA序列及氨基酸序列，構(gòu)建本地Blast數(shù)據(jù)庫。以水稻的OsDWARF/CYP85A(AB084385.1) cDNA序列進行本地BLAST比對，獲得2條序列，將其分別命名為PhCYP85A1和PhCYP85A2。PhCYP85A1和PhCYP85A2 CDS序列比對顯示，在3′端，PhCYP85A2堿基比PhCYP85A1少42 bp, 兩者序列相似度達93.68%(圖1)。因此，根據(jù)PhCYP85A1設(shè)計引物，以20個竹種DNA為模板進行序列擴增。所獲序列均在NCBI上進行BLAST比對，確認所獲序列均為CYP85A1同源基因。同時，將20個cDNA序列分別與PhCYP85A1和PhCYP85A2比對，所有序列與PhCYP85A1的同源性最高，確認所獲序列均與PhCYP85A1同源。序列比對顯示，毛竹中該基因與龜甲竹中該基因的DNA序列同源性達到99.17%，與親緣關(guān)系最遠的孝順竹中該基因的DNA序列同源性為81.83%。DNAMAN比對結(jié)果顯示，20個CYP85A1基因的DNA序列同源性達到92.23%，cDNA序列的同源性為98.79%，均含有9個外顯子和8個內(nèi)含子，表明其序列上高度保守(表1)。

注：帶箭頭的橫線為引物位置。Note：The horizontal line with arrows is the primer position.圖1 PhCYP85A1和PhCYP85A2 CDS序列比對Fig.1 The alignment of PhCYP85A1 and PhCYP85A2 coding sequences

2.2 20個竹種氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析

將所獲得的cDNA序列進行氨基酸序列預測，結(jié)果表明，除了龜甲竹、白紋陰陽竹和南平倭竹外，其余17個的cDNA在3′端CGA均變異為終止密碼子TGA，導致了提前終止，雖然所缺失的氨基酸數(shù)恰好與毛竹中CYP85A2缺失的氨基酸數(shù)相同，但共有區(qū)段均與CYP85A1的同源性更高。20個CYP85A1氨基酸序列同源性達到97.86%，均含有CYP85A基因家族幾個高度保守的結(jié)構(gòu)域，包括脯氨酸富集區(qū)、氧分子結(jié)合區(qū)、Glu-X-X-Arg結(jié)構(gòu)域和血紅素結(jié)合區(qū)(圖2)。

以孝順竹BmCYP85A1序列為例進行蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，孝順竹BmCYP85A1編碼的蛋白質(zhì)分子量為54.34 kDa，等電點為9.16，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)41.77，平均疏水性為-0.083，氨基酸含量前3位分別為亮氨酸(12.6%)、甘氨酸(7.7%)和精氨酸(7.1%)，脂肪指數(shù)為96.05。同時，二級結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn)，孝順竹BmCYP85A1蛋白序列中無規(guī)則卷曲約占26.15%，延伸鏈約占10.25%，α螺旋和β轉(zhuǎn)角分別占44.77%和18.83%(圖3)。二級結(jié)構(gòu)與水稻OsCYP85A1的結(jié)構(gòu)在中間區(qū)域相似，而在N和C末端存在差異。此外，孝順竹BmCYP85A1與水稻OsCYP85A1蛋白的三級結(jié)構(gòu)存在更明顯的差異(圖4)，如水稻OsCYP85A1蛋白的三級結(jié)構(gòu)中Ⅰ為β折疊結(jié)構(gòu)，孝順竹BmCYP85A1蛋白的三級結(jié)構(gòu)Ⅰ為loop結(jié)構(gòu)；Ⅱ在水稻中為β折疊結(jié)構(gòu)，在孝順竹中為α螺旋結(jié)構(gòu)；Ⅲ在水稻中為β折疊結(jié)構(gòu)，在孝順竹中為α螺旋結(jié)構(gòu)，綜上表明二者結(jié)構(gòu)的差異可能導致其功能上存在一定區(qū)別。

表1 20個竹種中PhCYP85A1基因序列信息Table 1 The detailed sequence information of CYP85A1 genes in 20 bamboo species

2.3 不同物種CYP85A蛋白進化樹分析

利用Mega 6軟件對不同物種中CYP85A蛋白序列構(gòu)建進化樹。由圖5可知，進化樹明顯分成雙子葉和單子葉2個分支，毛竹PhCYP85A1、PhCYP85A2和孝順竹BmCYP85A1與水稻OsCYP85A1同源性最近，聚類在1個分支上，表明他們親緣關(guān)系較近。

2.4 CYP85A1基因在不同組織中的表達分析

實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明，CYP85A1基因在孝順竹母竹和幼竹不同組織中均有表達，孝順竹母竹中CYP85A1基因在葉中的表達量最高，根中表達量最低；幼竹幼嫩節(jié)間(頂部和第5節(jié)間)中的表達量明顯高于母竹莖(第5節(jié)間)中的表達量。孝順竹幼竹5 m時，CYP85A1基因在第2節(jié)間中的表達量最低，頂部最高(圖6-A)。

CYP85A1基因在鳳尾竹母竹和幼竹不同組織中均有表達，表達模式與孝順竹類似，即在鳳尾竹母竹中，CYP85A1基因也表現(xiàn)為在葉中的表達量高，根中表達量最低，在鳳尾竹幼竹1 m時，CYP85A1基因在第2節(jié)間中表達量最低，頂部最高(圖6-B)。

圖2 CYP85A1氨基酸序列比對Fig.2 The alignment of CYP85A1 amino acid sequences

注：A：水稻OsCYP85A1蛋白; B：孝順竹BmCYP85A1蛋白。表示無規(guī)則卷曲;表示延伸鏈;表示α螺旋域。Note：A: OsCYP85A1 protein. B: BmCYP85A1 protein. means random coil. means extended strand. means alpha helix.圖3 CYP85A1二級結(jié)構(gòu)預測Fig.3 The prediction of CYP85A1 secondary structure

注：A：水稻OsCYP85A1蛋白; B：孝順竹BmCYP85A1蛋白。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ為水稻OsCYP85A1蛋白和孝順竹BmCYP85A1蛋白差異明顯的區(qū)域。Note：A: OsCYP85A1 protein. B: BmCYP85A1 protein.Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ are the regions with significant differences between OsCYP85A1 protein and BmCYP85A1 protein.圖4 CYP85A1三級結(jié)構(gòu)預測Fig.4 The prediction of CYP85A1 tertiary structure

2.5 CYP85A1基因在不同發(fā)育階段的表達分析

實時熒光定量PCR分析表明，在孝順竹1 m時，CYP85A1基因在第2節(jié)間中的表達量最高。在3 m時，CYP85A1基因在第4節(jié)間中的表達量最高，其次是頂部，第2節(jié)間中的表達量最低。在5 m和7 m時，CYP85A1基因在頂部表達量最高，且均顯著高于其他組織。孝順竹第2節(jié)間和第4節(jié)間在這4個不同發(fā)育階段的表達量均呈先上升后降低的趨勢；頂部CYP85A1基因的表達量隨著孝順竹株高的增加而增高，尤其在3～5 m這一快速生長階段，頂部CYP85A1基因表達量迅猛增加(圖7-A)。

變種鳳尾竹中CYP85A1基因在1 m時的表達量最高，1.8 m時次之，0.3 m時表達量最低。在0.3 m時第2節(jié)間表達量最高，在1 m和1.8 m時頂部表達量最高。第2節(jié)間和第4節(jié)間在3個不同發(fā)育階段CYP85A1表達量均呈先升高后降低的趨勢(圖7-B)。

聚類結(jié)果顯示，孝順竹中該基因編碼的氨基酸序列與單子葉植物中的CYP85A1親緣關(guān)系最近，而與雙子葉植物中的親緣關(guān)系更遠[21]。同時，對克隆所獲得的20種不同竹種CYP85A1氨基酸序列進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)聚類結(jié)果與株高相關(guān)性不大，但與地下莖類型大致吻合(圖8)。

3 討論

目前已經(jīng)在擬南芥[9,13]、水稻[14,22]、番茄[13]、豌豆[10]、菠菜[23]、黃瓜[24]和煙草[25]中分離獲得CYP85A1基因。多種植物中CYP85A1基因編碼的蛋白是BRs合成途徑中的關(guān)鍵酶，受BRs的負反饋機制調(diào)控[22,26]。本研究從20個竹種中獲得了CYP85A1的同源基因，這些同源基因所編碼的氨基酸序列都含有細胞色素P450家族的血紅素結(jié)合區(qū)、脯氨酸富集區(qū)和氧分子結(jié)合區(qū)和Glu-X-X-Arg結(jié)構(gòu)域，與多種植物中該基因的結(jié)構(gòu)類似[27]。

研究表明，BRs在植物的各個部位都可以合成，因此，在BRs合成過程中起重要作用的催化酶的編碼基因CYP85A1在各個組織中均可以檢測到表達，如擬南芥中的CYP85A1基因在所有檢測的組織中都有表達[13]。黃瓜的根、莖、葉、雌花和雄花中均可檢測到該基因的表達[24]。本研究結(jié)果表明，CYP85A1基因在孝順竹及其變種鳳尾竹的母竹和幼竹的不同組織和不同部位中均有表達，進一步驗證了由該基因編碼的催化酶催化合成的油菜素內(nèi)酯具有廣泛的生理功能，包括調(diào)節(jié)植物根的生長、莖的伸長以及葉的伸展[28-29]。

圖5 CYP85A蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.5 The phylogentic tree of CYP85A proteins

注：不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著。下同。Note：R:Root. S:Stem. L:Leaf. LB:Lateral branch. 2nd Ⅰ:Second internode. 4th Ⅰ:Fourth internode. 5th Ⅰ:Fifth internode. T:Top. Different capital letters indicate significant difference at 0.01 level. The same as following.圖6 CYP85A1基因在孝順竹(A)和鳳尾竹(B)不同組織中的表達分析Fig.6 Expression analysis of CYP85A1 genes in different tissue of the Bambusa multiplex (A) and Bambusa multiplex Fernleaf (B)

圖7 CYP85A1基因在孝順竹(A)和鳳尾竹(B)不同發(fā)育階段的表達分析Fig.7 Expression analysis of CYP85A1 gene in different developmental stages of the Bambusa multiplex (A) and the Bambusa multiplex Fernleaf (B)

圖8 竹種CYP85A1進化樹Fig.8 The phylogentic tree of CYP85A1 in bamboo

BR的合成存在于植物的各個組織，合成過程中催化酶的編碼基因在植物各組織中均有表達，但一般情況下，與成熟組織相比，生長過程中的幼嫩組織的BR含量相對較高[30]。即催化酶的編碼基因在幼嫩組織中的表達量比成熟組織中的高，本研究在檢測該基因組織特異性表達時，所用的根和莖是已完成形態(tài)建成的組織，而葉用的是尚未成熟的嫩葉，因此，該基因在葉中的表達量更高，這與前人對菠菜的研究結(jié)果一致[23]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，CYP85A1基因在快速生長的組織中的表達量高于其他組織中的表達量，如在豌豆中，當種子快速生長時，CYP85A1基因的轉(zhuǎn)錄水平達到最高,種子萌發(fā)早期CYP85A1基因的轉(zhuǎn)錄水平也較高；在豌豆苗中，CYP85A1基因在根和莖中的表達量最高[31]。發(fā)育的番茄果實中CYP85A1轉(zhuǎn)錄瞬時增加[9]。本研究結(jié)果也表明孝順竹中的CYP85A1基因在快速伸長的節(jié)間中的表達量顯著高于其他節(jié)間中的表達量。在孝順竹1 m株高時，第2節(jié)間的生長速率比第4節(jié)間和頂部的生長速率高，CYP85A1基因在該節(jié)間表達量最高。孝順竹從1 m長到3 m，第2節(jié)間生長趨于停止，第4節(jié)間快速伸長，頂部準備進入伸長階段，CYP85A1基因在第4節(jié)間的表達量最高，頂部次之。從3 m生長到5 m時，第2、第4節(jié)間平均日伸長量分別為0.05、0.2 cm，而頂部節(jié)間日伸長量達到0.7 cm。在此快速生長階段，CYP85A1基因在第2節(jié)間中的表達量最低，頂部最高。同時，在竹子快速拔節(jié)期間，CYP85A1基因大量表達促進了BRs的大量合成，進而促進了節(jié)間快速伸長，這與水稻中的研究結(jié)果一致[32]。雖然孝順竹與其變種鳳尾竹的表達模式類似，但在同時出土的植株中，鳳尾竹(0.3 m)中CYP85A1的整體表達量比孝順竹(1 m)高，這是否與孝順竹和鳳尾竹的不同生理狀態(tài)有關(guān)，尚有待進一步的研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，竹類植物CYP85A1基因包含9個外顯子和8個內(nèi)含子，氨基酸序列包含細胞色素P450家族的血紅素保守結(jié)構(gòu)域、富含脯氨酸和氧的結(jié)構(gòu)域和Glu-X-X-Arg結(jié)構(gòu)域；CYP85A1基因在孝順竹和其變種鳳尾竹不同組織均有表達，但表達量存在差異，在竹子不同生長發(fā)育時期，表達量也存在明顯差異；在快速拔節(jié)階段，竹子節(jié)間生長速率越快，生長長度越長，CYP85A1基因的表達量越高。綜上表明竹類植物CYP85A1基因參與節(jié)間的快速伸長及莖稈的發(fā)育，這為了解竹類植物節(jié)間快速伸長機制提供了依據(jù)，下一步可對竹類植物CYP85A1基因的調(diào)控機理進行更深入的研究。