廖長見 秦 燕 陳 琦 張 揚(yáng) 陳山虎 林海建,*

(1 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福建 福州 350013；2 成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川 成都 611130；3 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所，四川 成都 611130)

玉米(ZeamaysL.)是世界重要的糧食、經(jīng)濟(jì)和飼料作物，也是我國種植面積最大的作物之一。自1986年在玉米上首次利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化抗除草劑pat基因并獲得陽性植株以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米基因功能驗(yàn)證、性狀遺傳改良等方面發(fā)揮著重要的作用[1-3]，且利用該技術(shù)已獲得包括抗蟲、抗除草劑等多個(gè)性狀的轉(zhuǎn)基因新材料[4-6]。受體材料的篩選是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的重要環(huán)節(jié)[7]。在玉米上已報(bào)道可作為轉(zhuǎn)基因受體的材料包括胚性愈傷組織、原生質(zhì)體、胚性細(xì)胞懸浮系、幼嫩子房、花粉、莖尖等[7-10]，其中胚性愈傷組織是玉米遺傳轉(zhuǎn)化上最常用的受體材料。目前已有采用不同基因型幼胚作為外植體成功誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的報(bào)道[11-12]，且存在誘導(dǎo)效率和遺傳轉(zhuǎn)化效率的基因型差異[13]。經(jīng)過多年的探索，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所建立了較為成熟的以玉米幼胚愈傷組織為受體的遺傳轉(zhuǎn)化體系[14]。然而，目前的研究多采用二倍體幼胚直接誘導(dǎo)愈傷進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，而要獲得純合的陽性植株則需要經(jīng)過連續(xù)多代的自交純合，在自交過程容易造成外源基因的丟失，影響轉(zhuǎn)化效果[15]。

單倍體技術(shù)是繼轉(zhuǎn)基因技術(shù)外，另一項(xiàng)重要的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)。在玉米中，通過誘導(dǎo)系外源誘導(dǎo)可產(chǎn)生一定比例的母本單倍體，這些單倍體材料再經(jīng)自然或化學(xué)加倍獲得100%純合二倍體植株(DH系)，極大縮短了玉米自交系選育年限[16]。目前單倍體技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于玉米自交系選育、突變育種和相關(guān)遺傳研究[17-18]。

近年來，由于單倍體細(xì)胞(或組織)特殊的染色體組成，其在基因功能研究中的作用受到人們的廣泛關(guān)注，在單倍體材料或組織中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證，可以在轉(zhuǎn)基因當(dāng)代獲得轉(zhuǎn)基因表型，極大縮短基因功能驗(yàn)證所需的時(shí)間[19]。玉米單倍體技術(shù)將紫色標(biāo)記基因?qū)胝T導(dǎo)系，再與母本材料進(jìn)行雜交，雜交二倍體籽粒和植株因含父本的紫色標(biāo)記基因，其胚、芽、根系、莖稈等組織均會(huì)表型出不同程度的紫色，而僅源于母本的單倍體則不含任何父本(誘導(dǎo)系)基因，因此不會(huì)表型出雜交二倍體的特征，運(yùn)用此方法可快速準(zhǔn)確地區(qū)分單倍體和二倍體[20-21]。然而，幾乎所有的標(biāo)記基因表達(dá)通常要延遲到籽粒灌漿后期，而單倍體幼胚的挑取一般在授粉后12 d左右，此時(shí)難以區(qū)分單倍體和二倍幼胚，且單倍體誘導(dǎo)率一般低于10%[22-24]。目前已有利用單倍體材料作為遺傳轉(zhuǎn)化受體的研究報(bào)道[25]，但對(duì)玉米單倍體胚性愈傷誘導(dǎo)和篩選的報(bào)道并不常見。如果在幼胚或愈傷組織繼代前不進(jìn)行初次篩選，后期的工作將變得非常困難，因此建立一套簡單的單倍體愈傷早期篩選體系對(duì)開展玉米單倍體遺傳轉(zhuǎn)化研究具有重要意義[26]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米優(yōu)良轉(zhuǎn)基因受體材料為18-599紅，玉米單倍體誘導(dǎo)系MT-1 (對(duì)18-599紅的單倍體誘導(dǎo)率約為3%～4%)，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單倍體幼胚的體外誘導(dǎo) 以單倍體誘導(dǎo)系MT-1為父本，18-599紅為母本進(jìn)行單倍體誘導(dǎo)，取授粉后12 d果穗全部籽粒于無菌超凈工作臺(tái)挑取幼胚于改進(jìn)后的普通誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組成詳見表1。每個(gè)培養(yǎng)基接種16顆幼胚，累計(jì)接種3 000粒左右。于26±2℃暗培養(yǎng)，3 d后盾片開始膨大，同時(shí)胚根和胚芽也有不同程度的生長，應(yīng)注意及時(shí)將胚根和胚芽切掉，20 d后觀察愈傷組織誘導(dǎo)狀況。

1.2.2 單倍體愈傷的初次篩選 為了節(jié)省后期工作量，待幼胚誘導(dǎo)形成愈傷并培養(yǎng)20 d后采用光照培養(yǎng)進(jìn)行單倍體愈傷的初次篩選。將誘導(dǎo)出愈傷組織的材料及正常的二倍體材料均在28℃培養(yǎng)，設(shè)置暗培養(yǎng)、全光照培養(yǎng)(光照強(qiáng)度為2 000 lx)和光暗周期培養(yǎng)(光周期為14 h光照/10 h黑暗，光照強(qiáng)度為2 000 lx)3種光照培養(yǎng)方式，均分別培養(yǎng)0、1、5、10、20、40 h。觀察愈傷組織顏色變化情況并篩選出未變色材料作為擬單倍體。

表1 本試驗(yàn)使用的主要培養(yǎng)基類型及組成Table 1 The types and components of the medium used in this experiment

1.2.3 細(xì)胞壓片觀察 參照蔡華等[27]的方法并略作改動(dòng)。對(duì)FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測后的擬單倍體愈傷進(jìn)行壓片觀察，具體操作步驟：取1 mm左右的愈傷組織浸泡在α-溴奈中進(jìn)行預(yù)處理3～4 h，經(jīng)流水沖洗后于卡諾液(3份甲醇∶1份冰乙酸)中固定3 d，采用95%乙醇洗滌2次并于70%乙醇中保存?zhèn)溆?。取出固定好的愈傷組織，無菌水沖洗7 min，吸水紙吸干。放入盛有適量1 mol·L-1HCl、60℃的離心管中水浴保溫，解離10 min。解離后的材料經(jīng)無菌水沖洗5 min并吸干，取0.2 mm左右的愈傷組織于載玻片上壓碎打散，滴加1～2滴卡寶品紅染液，染色10～15 min，壓片。在待染色的材料上加1滴染液，蓋上蓋玻片，覆一層吸水紙，用帶橡皮頭的鉛筆垂直敲打，或以拇指垂直緊壓蓋片，使材料分散壓平。利用OLYMPUS相差顯微鏡(CKX53PH，日本)觀察愈傷組織細(xì)胞染色體數(shù)目。

1.2.4 流式細(xì)胞儀篩選 參照張虹等[28]的方法并略作改動(dòng)，對(duì)細(xì)胞壓片檢測后的擬單倍體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。具體步驟：取愈傷組織材料0.5～1.0 g，放入1 mL Otto Ⅰ buffer(pH值2.3的0.1 mol·L-1檸檬酸 +0.5%(v/v) Tween 20)中用鋒利的刀片切碎、過濾、收集濾液，5 000 r·min-1離心5 min后，棄上清至100 mL， 再加入100 mL Otto Ⅰ buffer 于4℃保存。加入Otto Ⅱ buffer(pH值8.9的0.4 mol·L-1Na2HPO4·12H2O)和RNase后用50 mg·mL-1碘化丙啶(pmpidium iodide，PI)染色，染液對(duì)細(xì)胞核DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，置于暗處30 min后用Cyto FLEX流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特，美國)進(jìn)行植株倍性鑒定。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性檢測，并用cellQuest軟件(美國BD公司)獲取數(shù)據(jù)，ModFit軟件(Yerity Software House公司，美國)分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚性愈傷組織誘導(dǎo)情況

在誘導(dǎo)系誘導(dǎo)母本材料18-599(紅)12 d后，通過未成熟籽粒的表皮和幼胚顏色來區(qū)分單倍體和二倍體較困難，因此，只能挑取果穗上的全部幼胚進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。由圖1可知，按照正常二倍體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)，除極少數(shù)幼胚壞死外，絕大部分幼胚均能正常誘導(dǎo)獲得愈傷組織。在愈傷組織形成的早期，絕大部分二倍體愈傷組織并不能表現(xiàn)出紫色，因此難以通過表型進(jìn)行篩選。

注：A、B、C、D分別表示愈傷培養(yǎng)2、4、10、20 d的生長情況。Note: A, B, C and D indicate the growth condition in callus in 2, 4, 10 and 20 days, respectively.圖1 玉米單倍體和二倍體愈傷組織誘導(dǎo)與生長情況Fig.1 The Induction and growth condition of maize haploid and diploid callus

2.2 光照誘導(dǎo)部分二倍體愈傷顯色

由圖2可知，在暗培養(yǎng)、光照培養(yǎng)和光暗周期培養(yǎng)5 h后，二倍體愈傷開始顯色，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，二倍體紫色顯色率均增加，光暗周期培養(yǎng)組增加幅度最明顯，但方差分析表明，不同光照培養(yǎng)方式對(duì)二倍體紫色顯色率影響不顯著，而光照時(shí)間對(duì)二倍體紫色顯色率達(dá)極顯著水平(表3)。通過對(duì)光暗周期培養(yǎng)時(shí)間LSD檢測表明，二倍體愈傷在光照20 h和40 h的紫色愈傷檢出率差異不顯著(表4)，綜合分析確定二倍體愈傷初篩的最佳方式為光暗周期培養(yǎng)20 h、光照強(qiáng)度為2 000 lx。

圖2 不同光照培養(yǎng)方式對(duì)二倍體紫色愈傷率的影響Fig.2 Effect of different light culture types on the diploid color rate (purple rate) of diploid

變異來源Variation平方和SS自由度df均方MSF值F valueF0.05F0.01光照方式Light types428.112214.063.204.107.56光照時(shí)間Light time10 457.6152 091.5231.253.335.64誤差Deviation669.221066.92總變異Total variation11 554.9417

注：**表示差異極顯著。

Note:**indicate significant difference at 0.01 level.

表4 不同光照時(shí)間處理的多重比較Table 4 The result of light time dispose multiple comparison

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note: Different lowercase indicates significant difference at 0.05 level. Different uppercase indicate extremely significant difference at 0.01 level.

2.3 細(xì)胞壓片觀察和流式細(xì)胞儀檢測單倍體愈傷

經(jīng)細(xì)胞壓片篩選獲得的擬單倍體愈傷再經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，有二倍體愈傷的存在(圖3-A、C)；而先經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，再經(jīng)細(xì)胞壓片分析則無二倍體愈傷(圖3-B,D)，表明流式細(xì)胞儀檢測單倍體愈傷的準(zhǔn)確率高于細(xì)胞壓片技術(shù)。通過對(duì)3 000個(gè)愈傷組織經(jīng)光照處理，壓片觀察和流式細(xì)胞儀檢測，最終篩選獲得單倍體愈傷110個(gè)，即單倍體愈傷率為3.67%，與單倍體誘導(dǎo)系MT-1對(duì)18-599紅的誘導(dǎo)率(3%～5%)基本一致。

3 討論

目前已有多個(gè)顏色標(biāo)記基因被成功導(dǎo)入玉米單倍體誘導(dǎo)系STOCK6中[29]，從而可以快速、簡便地通過胚、種皮和植株顏色標(biāo)記來區(qū)分單倍體和二倍體[16-17]。而顏色標(biāo)記基因主要在種子發(fā)育后期以及幼苗生長階段表達(dá)，未成熟的玉米幼胚和通過幼胚誘導(dǎo)獲得的愈傷組織則難以通過自身顏色的變化區(qū)分單倍體和二倍體[26]。前人研究表明，染色體壓片和流式細(xì)胞儀能有效的鑒定植物組織倍性，但這2種方法也存在操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、難以大規(guī)模應(yīng)用等缺點(diǎn)[30-31]。本研究通過光照篩選的方法可在早期鑒定愈傷組織，其二倍體愈傷的篩選率在培養(yǎng)20 h時(shí)可達(dá)68%，40 h時(shí)為71%。但光照時(shí)間過長，不僅延長了篩選時(shí)間，同時(shí)愈傷組織開始進(jìn)入分化階段[20]。綜合分析確定最適光照篩選處理為光照強(qiáng)度2 000 lx、20℃處理20 h，該處理?xiàng)l件可剔除超過60%的非單倍體愈傷，為后期的鑒定工作節(jié)省了大量的人力和時(shí)間。

圖3 玉米二倍體愈傷(A和C)與單倍體愈傷(B和D)的細(xì)胞學(xué)和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig.3 Cytological and flow cytometry results of maize diploid callus (A and C) and haploid callus(B and D)

常規(guī)壓片法是鑒定植物倍性最基本和最普遍的方法，但其對(duì)技術(shù)要求很高，對(duì)細(xì)胞核較小或染色體對(duì)數(shù)多的植物鑒定準(zhǔn)確性不高，同時(shí)易受取樣范圍和觀察視野的影響[32]。而流式細(xì)胞技術(shù)主要用于檢測植物細(xì)胞核DNA含量及其倍性水平，以其高通量、高靈敏度等優(yōu)勢已被廣泛應(yīng)用于植物倍性檢測[33-34]。本研究對(duì)染色體壓片和流式細(xì)胞儀鑒定單倍體愈傷的準(zhǔn)確性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)通過壓片技術(shù)檢測的單倍體染色體樣本中經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，仍然發(fā)現(xiàn)了二倍體細(xì)胞的存在，而經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測后的擬單倍體愈傷再經(jīng)染色體壓片觀察并無二倍體細(xì)胞的存在，表明傳統(tǒng)的壓片技術(shù)鑒定植物倍性并不十分準(zhǔn)確，其原因可能是在愈傷組織的發(fā)育過程中，某些細(xì)胞會(huì)自發(fā)加倍成為二倍體，形成二倍體與單倍體細(xì)胞同時(shí)存在的嵌合體，這在玉米單倍體植株中也是經(jīng)常發(fā)生的，因這部分愈傷并不顯色，難以與單倍體進(jìn)行區(qū)分，且嵌合體并不具有單倍體愈傷所具備的作為轉(zhuǎn)基因受體材料的優(yōu)勢。此外，流式細(xì)胞儀通過峰值和數(shù)量來判定植物組織倍性，單倍體出現(xiàn)單一的峰，而嵌合體和二倍體則會(huì)出現(xiàn)多峰現(xiàn)象，可以較準(zhǔn)確地鑒定愈傷組織的倍性，同時(shí)還能準(zhǔn)確區(qū)分二倍體和嵌合體。流式細(xì)胞儀操作較壓片技術(shù)簡單，但因儀器和測定費(fèi)用偏貴，成為大規(guī)模單倍體愈傷鑒定的主要障礙。本研究通過光照初步篩選，然后再采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行精確鑒定，迅速從3 000個(gè)單倍體愈傷中篩選獲得單倍體愈傷110個(gè)，單倍體愈傷率3.67%，與誘導(dǎo)系MT-1對(duì)18-599紅的單倍體誘導(dǎo)率(3%～5%)相似，進(jìn)一步說明了篩選和鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本研究在玉米二倍體愈傷培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，成功誘導(dǎo)出單倍體愈傷組織，并通過光暗周期培養(yǎng)剔除了大部分非單倍體愈傷，極大節(jié)省了前期單倍體愈傷篩選時(shí)間。結(jié)合流式細(xì)胞儀鑒定單倍體愈傷，其準(zhǔn)確性更高，可作為玉米單倍體愈傷篩選的重要方法，本研究結(jié)果為后期利用單倍體愈傷作物遺傳轉(zhuǎn)化受體材料的應(yīng)用奠定了一定的理論與材料基礎(chǔ)。