彭昶璠 徐路星 羅世男 王霜寧 袁檢寶 李霞

作者單位：530021 廣西壯族自治區(qū)南寧市，廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科

角膜病是僅次于白內(nèi)障的第二大致盲性眼病，占整個角膜厚度90%的角膜基質(zhì)損傷后的瘢痕化修復(fù)是角膜在外傷、炎癥愈合后視力下降的主要原因。因此，研究角膜基質(zhì)創(chuàng)傷修復(fù)的病理過程、探尋減少角膜基質(zhì)瘢痕化的治療方法對于防治角膜盲具有重要意義。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)參與并介導(dǎo)了角膜損傷修復(fù)的過程，造成角膜基質(zhì)細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)纖維化，進而引起病理性ECM沉積，最終導(dǎo)致瘢痕形成[1]。我們在前期研究工作中建立了Pellet體外三維培養(yǎng)模型，證實TGF-β可導(dǎo)致ECM纖維化[2-3]。角膜創(chuàng)傷修復(fù)過程中TGF-β具有時間、空間動態(tài)分布的特點[4-5]，已有研究關(guān)注生長因子對角膜基質(zhì)創(chuàng)傷修復(fù)的影響，但對于生長因子空間分布對修復(fù)過程的影響研究卻較少。本研究在前期研究工作基礎(chǔ)上，應(yīng)用Transwell三維培養(yǎng)系統(tǒng)，結(jié)合透析膜進行改良，以構(gòu)建模擬TGF-β空間動態(tài)分布的體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)，為研究角膜基質(zhì)創(chuàng)傷修復(fù)提供候選模型。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器DMEM/F-12(11)培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；Ⅰ型膠原酶(北京索萊寶公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；TaqDNA聚合酶、MLV逆轉(zhuǎn)錄體系、PCR引物(日本Takara公司)；TGF-β1、TGF-β2(美國Thermo Fisher公司)；6孔0.4 μm孔徑Transwell細胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)；相對分子質(zhì)量 15 000 生物級高精度即用型透析袋(北京索萊寶公司)；超凈工作臺(蘇凈AIRTECH公司)；恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Therma Forma公司)；高速低溫離心機(德國Eppendorf Centrifuge公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2原代牛角膜基質(zhì)細胞的獲取在屠宰場取新鮮成年牛眼球置于冰盒中，予碘伏和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗3遍后沿角鞏膜緣內(nèi)側(cè)約2 mm處環(huán)形剪出角膜，在無菌操作臺上用PBS和DMEM/F12(11)培養(yǎng)基清洗后用無菌手術(shù)刀片刮除上皮層和內(nèi)皮層。再次用DMEM/F12(11)培養(yǎng)基清洗后，用眼科剪將角膜剪碎至約1.0 mm×1.0 mm大小的組織塊，置于含2 g·L-1I型膠原酶的 DMEM/F12(11)培養(yǎng)基中，放在 37 ℃ 恒溫箱中避光消化4 h后得細胞懸液。用孔徑200 μm的過濾網(wǎng)過濾細胞懸液，1000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入培養(yǎng)基[體積分數(shù)10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)+DMEM/F12，11]按 200×103個·cm-2細胞密度接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，獲得原代牛角膜基質(zhì)細胞。

1.3構(gòu)建Pellet、Transwell與透析袋相結(jié)合三維培養(yǎng)系統(tǒng)

1.3.1結(jié)合透析袋的Transwell小室系統(tǒng)制作在無菌操作臺內(nèi)用PBS沖洗透析袋3次后依照Transwell小室尺寸用眼科剪進行裁剪，以透析袋能從外部全面包裹小室且不超過小室頂部為宜，抹平小室濾過膜與透析袋間氣泡，用無菌橡皮圈將透析袋固定在小室外側(cè)。

1.3.2實驗分組原代細胞貼壁80%以上時傳代，當(dāng)傳代細胞達到80%融合時收集于15 mL離心管中，1000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，加入體積分數(shù)10%FBS后再次離心即為Pellet模型。將建好的Pellet模型分為有透析袋組和無透析袋組，分別置于結(jié)合透析袋和不結(jié)合透析袋的Transwell的上室、下室進行培養(yǎng)，48 h后換液，其中上室為0.50 μg·L-1TGF-β1+0.25 μg·L-1TGF-β2+體積分數(shù)10%FBS，下室為體積分數(shù)10%FBS，分別培養(yǎng)72 h后進行后續(xù)實驗。自然光條件下肉眼觀察Pellet的形態(tài)，并拍照記錄。

1.4實時熒光定量PCR法檢測應(yīng)用實時熒光定量(Real-time) PCR法檢測三維培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)Pellet樣本α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ，Col Ⅰ)、Col Ⅲ mRNA的表達，Pellet培養(yǎng)后72 h進行Real-time PCR檢測，目的基因α-SMA的上下游引物序列分別為：5’-CTAACAACGTCCTCTCCGGG-3’、5’-GACAAGAGAGCAGGGAGTGTC-3’，F(xiàn)N的上下游引物序列分別為：5’-CACCAACGAACTTGCACCTG-3’、5’-CTGATCGGCATGGACCACTT-3’，Col Ⅰ的上下游引物序列分別為：5’-TTCAGCTTTGTGGACCTCCG-3’、5’-CGTTCTGTACGCAGGTGACT-3’，Col Ⅲ的上下游引物序列分別為：5’-TGAAAGGCCCAGCTGGTATG-3’、5’-CCATCATTACCTCGAGCCCC-3’，內(nèi)參基因β-肌動蛋白的上下游引物序列分別為：5’-GCAGAAAGAGATCACTGCCC-3’、5’-TAACGCAGC-TAACAGTCCGC-3’。各基因的相對表達量參考文獻[3]用2-ΔΔCt法計算。

2 結(jié)果

2.1牛角膜基質(zhì)細胞體外二維培養(yǎng)48h后的生長情況倒置相差顯微鏡下見，牛角膜基質(zhì)細胞體外二維培養(yǎng)48 h后貼壁生長，伸展呈梭形(圖1)。

圖1 倒置相差顯微鏡牛角膜基質(zhì)細胞體外二維培養(yǎng)48 h后細胞形態(tài)(×100)

2.2Pellet模型的生長情況Pellet模型在培養(yǎng)后48 h開始呈團狀生長，在Transwell小室系統(tǒng)培養(yǎng)后72 h Pellet模型的結(jié)構(gòu)均穩(wěn)定(圖2)，2組Pellet模型外觀上無明顯差異。

圖2 Pellet模型生長情況。A：48 h開始呈團狀生長，形成Pellet；B：有透析袋組培養(yǎng)72 h Pellet在Transwell上下室呈團狀生長；C：無透析袋組培養(yǎng)72 h Pellet在Transwell上下室呈團狀生長

2.3培養(yǎng)72h后各組Pellet模型中目的基因mRNA的表達

2.3.1Pellet在有透析袋組上室與下室各目的基因mRNA表達Pellet模型在Transwell小室系統(tǒng)培養(yǎng)后72 h，有透析袋組上室細胞4種基因mRNA表達均明顯高于下室細胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(tα-SMA=4.073、tFN=0.069、tCol Ⅰ=3.839、tCol Ⅲ=1.531，均為P=0.000)。有透析袋組上室細胞的Col Ⅲ/Col Ⅰ比值為1.126±0.019，有透析袋組下室細胞的Col Ⅲ/Col Ⅰ比值為0.957±0.013，有透析袋組上室的Col Ⅲ/Col Ⅰ比值顯著高于下室，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.137，P=0.000)。見表1。

2.3.2Pellet在無透析袋組上室與下室各目的基因的mRNA表達Pellet模型在Transwell小室系統(tǒng)培養(yǎng)后72 h，無透析袋組上室與下室細胞中4種基因mRNA比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(tα-SMA=8.300，P=0.845；tFN=1.202，P=0.631；tCol Ⅰ=3.148，P=0.879；tCol Ⅲ=0.027，P=0.904)。Pellet模型在Transwell小室系統(tǒng)培養(yǎng)后72 h，無透析袋組上室細胞的Col Ⅲ/Col Ⅰ比值為1.157±0.029，無透析袋組下室細胞的Col Ⅲ/Col Ⅰ比值為1.163±0.090，無透析袋組上室的Col Ⅲ/Col Ⅰ比值與下室無明顯差異(t=0.239，P=0.651)。見表1。

2.3.3Pellet在無透析袋組上、下室與有透析袋組組上、下室各目的基因mRNA表達情況Pellet模型在Transwell小室系統(tǒng)培養(yǎng)后72 h，無透析袋組上室細胞中α-SMA、FN、Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA的相對表達量與有透析袋組上室、有透析袋組下室比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(tα-SMA上室=0.570，P=0.000；tα-SMA下室=2.463，P=0.000；tFN上室=1.364，P=0.000；tFN下室=0.334，P=0.002；tCol Ⅰ上室=2.957，P=0.001；tCol Ⅰ下室=0.571，P=0.000；tCol Ⅲ上室=0.191，P=0.002；tCol Ⅲ下室=0.512，P=0.000)。見表1。

Pellet模型在Transwell小室系統(tǒng)培養(yǎng)后72 h，無透析袋組下室細胞中α-SMA、FN、Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA的相對表達量與有透析袋組上室、有透析袋組下室比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(tα-SMA上室=8.505，P=0.000；tα-SMA下室=2.090，P=0.000；tFN上室=0.006，P=0.000；tFN下室=0.046，P=0.001；tCol Ⅰ上室=0.091，P=0.002；tCol Ⅰ下室=4.371，P=0.006；tCol Ⅲ上室=0.023，P=0.003；tCol Ⅲ下室=0.494，P=0.000)。見表1。

表1 2組上室及下室各基因mRNA表達量比較

注：Fα-SMA分組=381.086，P=0.000；FFN分組=153.937，P=0.000；FCol Ⅰ分組=72.767，P=0.000；FCol Ⅲ分組=172.043，P=0.000

3 討論

在角膜損傷修復(fù)過程中，TGF-β在空間及時間上具有動態(tài)分布的特點。TGF-β1可促進成纖維細胞增殖、分化及促進間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為成纖維細胞[6]；TGF-β2則參與了損傷區(qū)域成纖維細胞的聚集，引發(fā)膠原合成[7]。在角膜創(chuàng)傷修復(fù)過程中，二者協(xié)同促進ECM纖維化。根據(jù)Huh等[8]和Fini等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在角膜創(chuàng)傷后12 h TGF-β2開始在增殖、遷移的角膜上皮細胞及活化的成纖維細胞中出現(xiàn)，在傷后48 h TGF-β1開始在角膜上皮細胞高度表達。在損傷初期二者即在損傷區(qū)域高表達，于傷后7 d達到高峰，而TGF-β1在損傷后7 d擴散到非損傷區(qū)。然而，TGF-β1在角膜創(chuàng)傷修復(fù)過程中在非損傷區(qū)的作用鮮有報道，在皮膚疾病領(lǐng)域則有研究表明TGF-β1可促進正常真皮基質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為成纖維細胞，并促進成纖維細胞向傷口的趨化，促進周邊未損傷區(qū)細胞向損傷區(qū)增殖遷移，進而促進創(chuàng)面收縮[10]。此外，現(xiàn)有體外創(chuàng)傷修復(fù)研究一般基于二維培養(yǎng)，實際上角膜損傷修復(fù)有空間和時間的動態(tài)變化，且損傷區(qū)與未損傷區(qū)存在相互影響。三維培養(yǎng)是二維培養(yǎng)與動物實驗之間連接的橋梁。相對于二維培養(yǎng)，體外三維培養(yǎng)能更好地模擬體內(nèi)角膜損傷修復(fù)的病理生理過程；雖然三維培養(yǎng)不能完全模擬動物實驗所發(fā)生的病理生理變化，但體外三維培養(yǎng)由于對實驗條件的精確控制較動物實驗好，因而常常用來研究病理生理過程、藥物篩查及組織工程學(xué)[11]。目前國際上有兩個課題組應(yīng)用三維培養(yǎng)研究角膜損傷修復(fù)病理生理過程[12-15]，但目前對TGF-β的空間分布進行模擬的三維培養(yǎng)模型尚未見報道。建立TGF-β空間分布的體外三維培養(yǎng)模型對研究角膜創(chuàng)傷修復(fù)損傷區(qū)及未損傷區(qū)相互作用的病理生理過程及抗瘢痕藥物的篩選均有幫助。

本研究利用Transwell結(jié)合透析袋建立TGF-β空間動態(tài)分布的角膜基質(zhì)創(chuàng)傷修復(fù)體外三維培養(yǎng)體系。Transwell目前廣泛應(yīng)用于共培養(yǎng)體系、趨化性實驗、腫瘤細胞侵襲實驗等研究中，對上下室進行了空間的分隔，在細胞共培養(yǎng)中提供空間分隔作用。TGF-β的相對分子質(zhì)量為25 000，而實驗室常用Transwell小室濾過膜孔徑最小規(guī)格為0.4 μm，TGF-β還是能通過Transwell小室濾過膜干擾下室。透析袋可根據(jù)實驗需要選擇不同的材料和截留相對分子質(zhì)量，可截留相對分子質(zhì)量為100～300 000的分子。本研究中選擇了截留相對分子質(zhì)量15 000的透析袋，理論上可阻隔相對分子質(zhì)量15 000以上的分子，可阻隔TGF-β向下室滲透。目前評估角膜基質(zhì)纖維化程度的主要研究指標包括α-SMA、FN、Col Ⅲ、Col Ⅰ 等基因的表達，Col Ⅲ/Ⅰ的比值增大亦是纖維化的標志。本研究應(yīng)用Real-time PCR檢測以上目的基因在mRNA水平上的表達以評估各組Pellet纖維化程度。本研究中對上室應(yīng)用含有TGF-β1、TGF-β2培養(yǎng)液后，上室Pellet高表達了α-SMA、FN、Col Ⅲ等基因，Col Ⅲ/Ⅰ的比值增大，提示上室的角膜基質(zhì)細胞啟動了纖維化的過程，下室中Pellet的以上纖維化標志物的表達及Col Ⅲ/Ⅰ的比值低于上室，下室不含TGF-β1，因此下室的角膜基質(zhì)細胞纖維化程度小。本研究培養(yǎng)48 h內(nèi)上下室培養(yǎng)液均為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，48 h后上室培養(yǎng)液改為含有0.5 μg·L-1TGF-β1聯(lián)合0.25 μg·L-1TGF-β2的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，是模擬角膜創(chuàng)傷修復(fù)中動物模型角膜傷口區(qū)TGF-β1及TGF-β2在48～72 h的高表達狀態(tài)。由于根據(jù)Huh等[8]的研究結(jié)果，小雞角膜損傷過程中，傷后7 d損傷區(qū)的TGF-β1擴展至傷口外角膜基質(zhì)后部及角膜內(nèi)皮細胞附近，故本研究中下室培養(yǎng)液在培養(yǎng)前的72 h是含體積分數(shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，模擬了未損傷區(qū)無TGF-β1在傷后72 h內(nèi)在未損傷區(qū)的無表達狀態(tài)[8]。無透析袋組上下室目的基因表達無顯著性差異，提示透析袋阻斷了上下室之間TGF-β1及TGF-β2的穿透。因此，應(yīng)用Transwell結(jié)合透析袋建立的TGF-β空間動態(tài)分布的角膜基質(zhì)創(chuàng)傷修復(fù)體外三維培養(yǎng)體系，可模擬角膜創(chuàng)傷修復(fù)過程中損傷區(qū)以及未損傷區(qū)TGF-β的動態(tài)變化，為研究角膜基質(zhì)創(chuàng)傷修復(fù)的病理生理過程及抗瘢痕藥物的篩查提供了更好的研究手段。然而，實際體內(nèi)環(huán)境中損傷區(qū)與非損傷區(qū)之間存在相對分子質(zhì)量大于25 000的物質(zhì)的交流，因此該模型仍存在一定局限性，有待今后進一步改進。