陳雨晴 簡守珺 岳娟 劉素素 李志杰 王麗婭

作者單位：450003 河南省鄭州市，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院，河南省立眼科醫(yī)院，河南省眼科研究所，河南省人民醫(yī)院，河南省眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(陳雨晴，簡守珺，岳娟，劉素素，王麗婭)；510632 廣東省廣州市，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院眼科研究所，暨南大學(xué)再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(李志杰)

真菌性角膜炎是一種由致病真菌感染引起的致盲率極高的感染性角膜病[1]。近幾年真菌性角膜炎患病率已上升到感染性角膜病的首位(占51%～70%)[2]。河南省是一個(gè)農(nóng)業(yè)大省，真菌性角膜炎的發(fā)病率較高，降低真菌性角膜炎致盲率的研究具有重要意義[3]。隨著生活水平的提高，含糖食品無處不在，尤其是兒童食品和飲料中，糖的含量普遍較高[4]。已有多項(xiàng)研究表明，過多食用高糖食品影響了機(jī)體正常的糖代謝，帶來多種危害[5-8]。本研究旨在探討高糖飲食對(duì)真菌性角膜炎病程的影響，以期指導(dǎo)真菌性角膜炎的治療。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組C57BL/6J雄性小鼠共78只，8～12周齡，體質(zhì)量23～28 g，購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。自由攝食、飲水，室溫18～24 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，每日12 h光照維持，晝夜循環(huán)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用均遵照美國視覺與眼科研究協(xié)會(huì)制定的科研動(dòng)物使用規(guī)范，經(jīng)河南省眼科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑及儀器D-果糖、Triton X-100(北京索萊寶科技有限公司)，F(xiàn)ITC/Gr-1、F4/80 PE (美國eBioscience)，小鼠白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)，牛血清白蛋白(中國BIOSHARP)。腐皮鐮刀菌(3.1791)標(biāo)準(zhǔn)菌株(北京中國科學(xué)院微生物研究所)。血糖儀(美國Roche)，雙光子激光掃描顯微鏡(德國Zeiss)，熒光顯微鏡(日本Nikon)，酶標(biāo)儀(美國EnVision-PerkinElmer)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將小鼠分為高糖飲食組和模型對(duì)照組，每組各39只。模型對(duì)照組給予正常飲用水，高糖飲食組給予含體積分?jǐn)?shù)10%果糖溶液，其他飼養(yǎng)條件相同。10 d后，兩組均建立真菌性角膜炎模型。期間每2 d定時(shí)測量兩組小鼠體質(zhì)量和血糖。

1.2.2真菌性角膜炎模型的建立小鼠腹腔注射80 mg·kg-1戊巴比妥鈉進(jìn)行全身麻醉，用10 g·L-1鹽酸丁卡因滴眼液進(jìn)行角膜表面麻醉，按照文獻(xiàn)[9]和[10]的方法建立雙眼真菌性角膜炎模型。菌種選用國內(nèi)最常見的致病真菌——腐皮鐮刀菌。

1.2.3小鼠模型的臨床觀察各組小鼠于造模后24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、120 h、168 h在裂隙燈顯微鏡下對(duì)角膜進(jìn)行臨床評(píng)分并拍照，臨床評(píng)分規(guī)則參照文獻(xiàn)[11]和[12]。

1.2.4角膜組織病理學(xué)觀察造模后24 h、48 h、72 h、168 h，兩組各時(shí)間點(diǎn)均分別處死2只小鼠，摘取雙眼眼球，在解剖顯微鏡下修剪角膜，固定、脫水、石蠟包埋后，在角膜中央以矢狀位做5 μm厚切片，二甲苯脫蠟，行HE染色和PAS染色，封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤情況觀察造模后24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、120 h、168 h，兩組各時(shí)間點(diǎn)均分別處死 3只小鼠，摘取雙眼眼球，取角膜，于20 g·L-1多聚甲醛溶液中固定60 min，PBS沖洗10 min×5次；1 g·L-1Triton 100-牛血清白蛋白破膜20 min；20 g·L-1牛血清白蛋白封閉20 min；加入FITC/Gr-1、F4/80 PE 4 ℃孵育過夜，PBS避光沖洗10 min×5次；將角膜平鋪于載玻片上，使用刀片將角膜均勻切分為四個(gè)扇形，且各角膜葉在角膜組織的中央部分相互連接，吸水紙吸去多余PBS，使用熒光封片膠封片。使用雙光子激光掃描顯微鏡對(duì)樣品進(jìn)行逐層掃描。將角膜瓣分別劃分為17個(gè)區(qū)域，觀察中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量及分布。用Imaris 7.2.1(Bitplane)圖像處理軟件對(duì)角膜鋪片各視野圖像中的中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞體積進(jìn)行逐層渲染，各視野所有層面的中性粒細(xì)胞體積之和即為整個(gè)角膜中性粒細(xì)胞的總體積，各視野所有層面的巨噬細(xì)胞體積之和即為整個(gè)角膜巨噬細(xì)胞的總體積。

1.2.6ELISA法測定IL-1β含量造模后24 h、48 h、72 h、120 h、168 h，兩組各時(shí)間點(diǎn)均分別處死2只小鼠，摘取雙眼眼球，取角膜，加入100 μL蛋白酶抑制劑，剪碎角膜，12 000 r·min-14 ℃離心20 min，取上清。BCA試劑盒測定角膜內(nèi)蛋白濃度。使用ELISA法檢測角膜中IL-1β的含量。在酶標(biāo)儀中讀取450 nm處的吸光度(A)值，并用已知標(biāo)準(zhǔn)溶液制備的特定校準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-1β的含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述計(jì)量資料。各組角膜病變臨床評(píng)分統(tǒng)計(jì)采用秩和檢驗(yàn)；各組角膜穿孔率比較采用卡方檢驗(yàn)；各組中性粒細(xì)胞體積、巨噬細(xì)胞體積、IL-1β含量比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組小鼠體質(zhì)量與血糖的比較自分組喂養(yǎng)開始后每2 d測量高糖飲食組和模型對(duì)照組小鼠體質(zhì)量，0～14 d兩組小鼠體質(zhì)量與血糖差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。見表1和表2。

2.2兩組小鼠真菌性角膜炎臨床表現(xiàn)裂隙燈顯微鏡下觀察(圖1)可見，真菌性角膜炎造模后24 h，兩組小鼠角膜均出現(xiàn)角膜基質(zhì)浸潤，高糖飲食組病灶范圍大于模型對(duì)照組。造模后48 h，兩組小鼠角膜混濁程度均進(jìn)一步加重，病灶區(qū)瞳孔和虹膜紋理均不可見，角膜緣均可見大量前房積膿，呈典型的真菌性角膜炎臨床表現(xiàn)。造模后72 h，兩組小鼠角膜均出現(xiàn)后彈力層膨出和新生血管，高糖飲食組相較于模型對(duì)照組后彈力層膨出發(fā)生率高，新生血管面積更大。兩組均在造模后120 h病變最為嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)角膜穿孔，高糖飲食組更為嚴(yán)重。兩組小鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)臨床評(píng)分見表3。造模后24 h、36 h、48 h、120 h、168 h，高糖飲食組小鼠角膜臨床評(píng)分均明顯高于模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

2.3兩組小鼠角膜穿孔率高糖飲食組與模型對(duì)照組均在造模后72 h開始出現(xiàn)角膜穿孔，此時(shí)兩組各剩余22只鼠44眼，其中高糖飲食組角膜穿孔35眼，未穿孔9眼，穿孔率為79.5%；模型對(duì)照組角膜穿孔18眼，未穿孔26眼，穿孔率為40.9%；兩組角膜穿孔率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.174，P=0.000)。

2.4兩組小鼠角膜組織病理學(xué)表現(xiàn)角膜組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，高糖飲食組炎癥反應(yīng)更重，角膜組織破壞更早且更為嚴(yán)重。HE染色結(jié)果顯示，高糖飲食組造模后24 h，中性粒細(xì)胞分布于感染角膜基質(zhì)全層；造模后72 h，中性粒細(xì)胞明顯增多，角膜淺層基質(zhì)壞死脫落，潰瘍形成；造模后168 h，角膜穿孔，虹膜脫出。模型對(duì)照組炎癥反應(yīng)相對(duì)較輕，恢復(fù)后的角膜厚度較高糖飲食組薄，且完整性更好。PAS染色結(jié)果顯示，兩組均為炎癥早期菌絲較多，隨著病程進(jìn)展菌絲逐漸減少；但高糖飲食組各時(shí)間點(diǎn)菌絲均明顯多于模型對(duì)照組。

2.5兩組小鼠角膜內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤體積高糖飲食組與模型對(duì)照組中性粒細(xì)胞浸潤體積均在造模后36 h到達(dá)高峰。高糖飲食組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)中性粒細(xì)胞浸潤體積均高于模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P=0.000)。見表4和圖2。

2.6兩組小鼠角膜內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤體積兩組小鼠巨噬細(xì)胞浸潤體積均在造模后72 h明顯升高。造模后24 h、36 h、48 h，兩組巨噬細(xì)胞浸潤體積相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，而在造模后72 h、96 h、120 h、168 h時(shí)，兩組巨噬細(xì)胞浸潤體積相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P=0.000)。見表5和圖2。

表1 兩組小鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量監(jiān)測

表2 兩組小鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)血糖監(jiān)測

圖1 兩組小鼠角膜真菌性角膜炎表現(xiàn)。注：Con示模型對(duì)照組，HFrD示高糖飲食組

2.7兩組小鼠角膜內(nèi)IL-1β含量兩組小鼠角膜內(nèi)IL-1β含量均在造模后24 h達(dá)到最高值。造模后24 h、48 h，高糖飲食組IL-1β含量均明顯高于模型對(duì)照組(均為P<0.05)。見表6。

表3 兩組小鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)角膜臨床評(píng)分

注：F分組=98.755，P=0.000；F時(shí)間=212.050，P=0.000

表4 兩組小鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)中性粒細(xì)胞浸潤體積

注：F分組= 5488.537，P=0.000；F時(shí)間=488.788，P=0.000

圖2 兩組造模后中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤情況。注：Con示模型對(duì)照組，HFrD示高糖飲食組，Gr-1示中性粒細(xì)胞，F(xiàn)480示巨噬細(xì)胞(標(biāo)尺=20 μm)

表5 兩組小鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)巨噬細(xì)胞浸潤體積

注：F分組= 849.069，P=0.000；F時(shí)間= 1484.918，P=0.000

表6 兩組小鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)角膜內(nèi)IL-1β含量

注：F分組= 9.188，P<0.05；F時(shí)間= 8702.128，P<0.05

3 討論

真菌性角膜炎是致盲率極高的感染性眼病，在我國居感染性角膜病致盲率的首位[13]。該病主要與植物外傷有關(guān)，其中常見的致病菌是腐皮鐮刀菌和黃曲霉菌[3]。本實(shí)驗(yàn)通過研究高糖飲食對(duì)小鼠真菌性角膜炎病程的影響，以期為臨床真菌性角膜炎患者的治療提供一定理論依據(jù)。

本研究通過對(duì)高糖飲食組與模型對(duì)照組小鼠體質(zhì)量與血糖監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，兩組各時(shí)間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，表明短期的高糖飲食并未打破小鼠的糖代謝平衡。統(tǒng)計(jì)真菌性角膜炎小鼠角膜臨床評(píng)分結(jié)果示，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)高糖飲食組臨床評(píng)分明顯高于模型對(duì)照組；組織病理學(xué)檢測結(jié)果示，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)高糖飲食組角膜水腫和炎癥浸潤程度高于模型對(duì)照組，角膜內(nèi)真菌量多于模型對(duì)照組。有研究表明，高糖飲食可能通過相關(guān)機(jī)制誘發(fā)癌癥的發(fā)生，引起胰島素抵抗、高胰島素血癥、甾體類激素生物利用度增加、氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)等[14-15]。Buyken等[16]認(rèn)為，高糖飲食與氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)相關(guān)的途徑可能為：高糖飲食導(dǎo)致餐后血糖大量升高，引起一氧化氮生成，隨后產(chǎn)生過氧化硝酸鹽，而過氧化硝酸鹽是潛在的促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)的分子。此外，相關(guān)研究已闡明，飲食中糖的攝入能激活人體炎癥反應(yīng)程序，其機(jī)制可能是膳食中糖類促進(jìn)肝臟中游離脂肪酸的合成，游離脂肪酸代謝產(chǎn)物誘發(fā)炎癥反應(yīng)及活性氧形成[17]。

真菌性角膜炎發(fā)生時(shí)，機(jī)體同時(shí)存在固有免疫與適應(yīng)性免疫，中性粒細(xì)胞是病程早期最活躍的炎癥細(xì)胞，能快速到達(dá)病灶部位消滅真菌[18]，但其殺滅真菌孢子時(shí)又會(huì)破壞角膜結(jié)構(gòu)[19]。眾多研究證明，在真菌性角膜炎感染晚期階段，巨噬細(xì)胞在獲得性免疫中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[20]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)真菌感染后角膜內(nèi)中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤體積計(jì)算后發(fā)現(xiàn)，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)高糖飲食組高于模型對(duì)照組，表明高糖飲食可能加劇了真菌性角膜炎炎癥免疫反應(yīng)，使角膜破壞嚴(yán)重，穿孔率增加。

在真菌性角膜炎中，IL-1β含量與角膜病變程度和炎癥細(xì)胞浸潤密切相關(guān)。造模后24 h、48 h，高糖飲食組IL-1β含量高于模型對(duì)照組，因宿主的炎癥反應(yīng)程度也是角膜損害的重要因素，IL-1β的早期高表達(dá)可能在角膜病變損害中起著重要作用。除此之外，高糖飲食導(dǎo)致腸道微生物菌群的變化，可使血漿內(nèi)脂多糖濃度升高，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和相關(guān)代謝性疾病發(fā)生[21]。

然而，關(guān)于高糖飲食對(duì)炎癥反應(yīng)影響的研究仍有爭議。Korntner等[7]在骨科方面的研究表明，在非糖尿病小鼠模型中，高糖飲食對(duì)肌腱的修復(fù)具有促進(jìn)作用。因此，高糖飲食在感染過程中也可能存在著促進(jìn)愈合的積極作用，這可能與糖的種類、劑量及感染的類型有關(guān)，未來仍需要深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，高糖飲食加劇了真菌性角膜炎的病情，但因真菌性角膜炎致病機(jī)制復(fù)雜，高糖飲食對(duì)真菌性角膜炎的影響及機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。