郭倩妤 石遠(yuǎn)菊 湯德元 葉 麗 楊 偉 廖少山 劉巧玲

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng)，550025)

近年來(lái)，隨著畜牧養(yǎng)殖的發(fā)展，特種經(jīng)濟(jì)類養(yǎng)殖也得到了迅速發(fā)展，目前梅花鹿養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益非?？捎^，梅花鹿(Cervusnippon)的養(yǎng)殖數(shù)量不斷增加，但是梅花鹿的疾病防治也顯得尤為重要，各類疫病的傳播已成為梅花鹿養(yǎng)殖的障礙[1]。日本乙型腦炎(Japanese encephalitis)是由黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivitus)日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一種危害嚴(yán)重的自然疫源性、蟲媒性人獸共患病[2]，畜禽感染率很高，多為隱性感染，該病的傳染媒介是蚊子，有明顯季節(jié)性，鹿多為隱性感染但也有散發(fā)死亡的，是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)確定的病毒性疫病[3]。該病毒在血液中存留時(shí)間較短，于中樞神經(jīng)系統(tǒng)與腫脹的睪丸內(nèi)存留時(shí)間長(zhǎng)。馬、豬、牛、羊、鹿、雞、鴨和鳥均能感染該病，馬最易感，牛、羊、鹿多呈隱性經(jīng)過(guò)[4]。JEV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1是病毒的主要抗原成分，能夠產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，此外NS1蛋白參與病毒的早期復(fù)制及病毒的組裝和釋放[5]。本研究測(cè)序分析了梅花鹿感染JEV的NS1部分基因，為防治梅花鹿JEV的感染奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料

病料來(lái)自貴州省梅花鹿養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病梅花鹿的4份血樣。

1.2 主要試劑

TaKaRa Min BEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒、One Step RT-PCR Kit Ver.2、DL-2 000 Marker、Sanprep 柱式DNA 膠回收試劑盒、Sanprep 柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，均購(gòu)自生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 布氏桿菌檢測(cè)

取被檢血清30 μL與抗原30 μL相混合，于4 min內(nèi)觀察結(jié)果，若反應(yīng)液呈均勻粉紅色，無(wú)凝集現(xiàn)象，則表示布氏桿菌陰性；若反應(yīng)液稍有卷邊形成，凝集物間液體呈紅色；形成明顯卷邊，凝集塊間液體稍清亮；凝集塊呈菌叢狀，凝集塊間液體清亮明顯，均表示布氏桿菌陽(yáng)性。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)表的日本乙型腦炎強(qiáng)毒株SA-14株(登錄號(hào)：M55506)的NS1基因設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物：JEV-F：GGAAGCCTGGGTGGATAGGT，JEV-R：GTAGTGGTTCTGACCGAAGGG，預(yù)擴(kuò)增片段大小為831 bp，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.5 梅花鹿JEV NS1基因的RT-PCR擴(kuò)增、克隆及序列分析

把送檢的4份血樣12 000 r/min 離心10 min，分別取200 μL上清，用TaKaRa Min BEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒提取總RNA，利用日本乙型腦炎NS1基因的引物進(jìn)行該病毒的鑒定。PCR擴(kuò)增體系總體積25 μL：2×1 Step Buffer：12.5 μL，DNA模板2.0 μL，上下游引物各1 μL，PrimerScript 1 Step Enzyme Mix：1 μL，用dd H2O補(bǔ)足25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃ 40 min；95℃ 5 min；94℃ 30 s，58.5℃ 30 s，72℃ 30 s，38個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取6 μL PCR產(chǎn)物于1%的1×TAE瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)(110 V，35 min)，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。經(jīng)RT-PCR鑒定陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物送昆泰銳(武漢)生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序，應(yīng)用DNAStar、MegAlign、MEGA 5.05軟件等把測(cè)序結(jié)果與GenBank上已收錄的國(guó)內(nèi)外毒株進(jìn)行核苷酸同源性分析及構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀觀察

發(fā)病梅花鹿下頜腫大(圖1-A)，單側(cè)睪丸腫脹(圖1-B)，前肢關(guān)節(jié)腫大(圖1-C)。

圖1 梅花鹿臨床癥狀觀察Fig.1 Observation of clinical symptoms of sika deer

2.2 布氏桿菌檢測(cè)

布氏桿菌虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，015號(hào)和039號(hào)為布氏桿菌陽(yáng)性。

圖2 布氏桿菌虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The Rose Bengal Plate test of brucella

2.3 JEV NS1部分基因的檢測(cè)及序列分析

JEV NS1基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示：4份梅花鹿的血樣均檢測(cè)出乙型腦炎病毒NS1基因的特異性條帶(圖3)。

圖3 JEV NS1基因 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The RT-PCR amplification result of JEV NS1 gene 注：M.DL-2000 Marker；1.陰性對(duì)照；2.JEV NS1陽(yáng)性對(duì)照；3.3—6為4頭鹿的血液樣品檢測(cè)結(jié)果 Note：M.DL-2000 Marker；1.Negative control；2.Ppositive control；3-6.They represent the blood samples of 4 deers

將上述PCR產(chǎn)物送昆泰銳(武漢)生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序，應(yīng)用MegAlign、MEGA 5.05等軟件把測(cè)序結(jié)果與GenBank上已收錄的國(guó)內(nèi)外毒株進(jìn)行核苷酸同源性分析及構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)分析。4份梅花鹿血樣檢測(cè)到的乙型腦炎病毒NS1部分基因序列(GZ-015、GZ-019、GZ-022、GZ-039)間的核苷酸同源性分別為99.9%、99.3%、99.4%，與強(qiáng)毒株SA-14、國(guó)內(nèi)外的疫苗株及四川、吉林等地的JEV分離株之間核苷酸同源性為99%以上(圖4)。

遺傳進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示：GZ-015、GZ-019、GZ-022、GZ-039與強(qiáng)毒株SA-14、弱毒株、國(guó)內(nèi)外的疫苗株及四川、吉林等地的JEV分離株處于同一個(gè)較大的遺傳進(jìn)化分支(圖5)。

圖4 JEV NS1基因核苷酸同源性分析Fig.4 The nucleotide homology analysis of JEV NS1 gene

圖5 JEV NS1基因遺傳進(jìn)化樹(shù)分析Fig.5 The genetic evolutionary tree analysis of JEV NS1 gene

3 討論

曾認(rèn)為乙型腦炎只在單蹄獸中發(fā)生，反芻獸都隱性感染不出現(xiàn)臨床癥狀，1980年長(zhǎng)春市動(dòng)物園因病損失仔鹿百余頭，試驗(yàn)結(jié)果表明被檢病鹿的死因是由JEV感染所致[6]。1980—1983年，在馬屬動(dòng)物流行期間，有的鹿場(chǎng)發(fā)現(xiàn)了具有中樞神經(jīng)癥狀和后軀麻痹的病鹿，經(jīng)過(guò)調(diào)查與研究，確認(rèn)在具有中樞神經(jīng)癥狀和后軀麻痹癥候群的病鹿中，有日本腦炎病例[7]。據(jù)報(bào)道，1986年調(diào)查吉林省鹿群中日本腦炎中和抗體陽(yáng)性率在60%—90%，但很少出現(xiàn)臨床癥狀和病死現(xiàn)象，說(shuō)明病鹿多數(shù)以隱性經(jīng)過(guò)[3]。

本次檢測(cè)貴州某梅花鹿場(chǎng)的發(fā)病梅花鹿出現(xiàn)下頜腫大、單側(cè)睪丸腫脹、前肢關(guān)節(jié)腫大等癥狀，015號(hào)血清和039號(hào)梅花鹿的血清檢測(cè)出了布氏桿菌感染，采集的4份血樣均檢測(cè)出了日本乙型腦炎病毒感染，4份梅花鹿血樣檢測(cè)到的乙型腦炎病毒NS1部分基因序列(GZ-015、GZ-019、GZ-022、GZ-039)間的核苷酸同源性分別為99.9%、99.3%、99.4%，與強(qiáng)毒株SA-14、國(guó)內(nèi)外的疫苗株及四川、吉林等地的JEV分離株之間核苷酸同源性為99%以上。遺傳進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示：GZ-015、GZ-019、GZ-022、GZ-039與強(qiáng)毒株SA-14、弱毒株、國(guó)內(nèi)外的疫苗株及四川、吉林等地的JEV分離株處于同一個(gè)較大的遺傳進(jìn)化分支，說(shuō)明本次從梅花鹿血樣中所檢測(cè)到的JEV NS1基因未發(fā)生變異。研究揭示黃病毒NS1的基因和表型具有高度同源性，其核酸序列可適用于7 種黃病毒，其中就有JEV，這就為NS1可能發(fā)展成為一種具有廣泛作用的黃病毒亞單位疫苗提供了理論依據(jù)[8]。金吉東[9]克隆了日本腦炎病毒 SA-14-14-2 株NS1基因測(cè)定并分析了其核苷酸序列，結(jié)果表明NS1基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 087 bp 編碼358 個(gè)氨基酸與GenBank 中收錄的同類毒株NS1基因序列完全一致，表明在該疫苗株多年應(yīng)用過(guò)程中 NS1 基因未發(fā)生變異，提示該疫苗株遺傳性狀比較穩(wěn)定。

藥物治療對(duì)病毒無(wú)效，結(jié)合4份梅花鹿血樣JEV NS1部分基因的測(cè)序分析結(jié)果，可對(duì)未發(fā)病的梅花鹿緊急使用日本腦炎弱毒活疫苗來(lái)預(yù)防該病的發(fā)生，對(duì)血清凝集反應(yīng)呈陰性的梅花鹿進(jìn)行布魯氏菌羊型疫苗接種。有癥狀的和無(wú)癥狀的分開(kāi)飼養(yǎng)，無(wú)癥狀的經(jīng)血清凝集反應(yīng)試驗(yàn)呈陰性的和呈陽(yáng)性的隔離飼養(yǎng)，對(duì)有癥狀的和無(wú)癥狀但凝集反應(yīng)試驗(yàn)呈陽(yáng)性的梅花鹿進(jìn)行撲殺、燒毀及深埋處理。