安博洋 安 月 王蘭芝 李 波，2*

(1.東北林業(yè)大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040；2.國家林業(yè)和草原局野生動植物檢測中心，哈爾濱，150040)

遺傳多樣性指地球上生物攜帶的所有遺傳信息，是生物多樣性的基礎和核心[1-2]。物種遺傳多樣性越豐富，其進化潛力越強，越能適應環(huán)境的變化。研究物種的遺傳多樣性，有利于了解該物種的遺傳結構及進化歷史，是制定物種保護和種質資源開發(fā)利用策略的前提[3]。

崖沙燕(Ripariariparia)隸屬于雀形目(Passeriformes)燕科(Hirundinidae)[4]，分布于除澳大利亞地區(qū)外的各個國家，在中國主要見于東北區(qū)、蒙新區(qū)及西南區(qū)[5-6]。崖沙燕在世界范圍內分為3個亞種：主要分布在歐亞大陸、美洲的指名亞種(R.r.riparia)，主要分布在遠東地區(qū)，從中國東部到東南亞的東北亞種(R.r.ijimae)，主要分布在埃及、以色列的埃及亞種(R.r.shelleyi)[7]。崖沙燕及其近緣物種的種群遺傳多樣性和遺傳結構引起了學者們的關注。Alexandra和Manuel利用NADH脫氫酶第二亞基(NADH dehydrogenase subunit 2，ND2)、肌肉特異性酪氨酸激酶Z連鎖基因第3內含子(Z-linked intron 3 of the muscle-specific tyrosine kinase，MUSK I3)及β-纖維蛋白原基因第7內含子(autosomal intron 7 of the beta-fibrinogen gene，fib7)研究了崖沙燕和淡色崖沙燕(Ripariadiluta)的系統(tǒng)發(fā)育關系和種群遺傳結構[7-8]。結果表明崖沙燕與淡色崖沙燕的分歧發(fā)生在大約3.07百萬年前(Mya)；所有崖沙燕個體聚集在同一支，而淡色崖沙燕分為兩個姐妹枝(中西伯利亞和蒙古)；北美和遠東的崖沙燕最早進行擴張，中西伯利亞的淡色崖沙燕進化歷史最短[7-8]。上述研究所采用的崖沙燕樣品主要來自歐洲、北美及中東地區(qū)，缺少中國東北地區(qū)的樣品信息。

ND2基因作為線粒體電子傳遞復合體的組分之一，具有更快的進化速率[9]，能反映出種群間遺傳關系差異，已經廣泛應用于鳥類種群遺傳和系統(tǒng)發(fā)育關系分析[10-13]。本研究測定了來自中國東北地區(qū)的崖沙燕東北亞種的ND2基因部分序列。結合GenBank中整理的國外崖沙燕ND2基因序列，探究崖沙燕3個亞種種群的遺傳多樣性和種群間遺傳結構，剖析其原因，為進一步開展崖沙燕的分子生物學研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究收集了產自齊齊哈爾市沙龍區(qū)的50只崖沙燕肌肉組織，樣本均由國家林業(yè)和草原局野生動植物檢測中心提供。同時從GenBank中下載104條崖沙燕的ND2基因同源序列。根據(jù)崖沙燕各亞種的地理分布情況，將所有樣本劃分為3個亞種種群(表1)。另外，在進行系統(tǒng)發(fā)育分析時，采用淡色崖沙燕(序列編號：MG881123)作為外群。

表1 崖沙燕ND2基因序列

Tab.1 ND2 gene sequences of Riparia riparia

續(xù)表1

注：*標注的登錄號來自Manuel[7]；其余登錄號來自Alexandra[8]；編號個體由本實驗擴增獲得

Note：* Marked accession numbers from Manuel[7]，and the others are from Alexandra[8].Numbered individuals obtained from this experiment

1.2 PCR擴增與測序

肌肉樣本經過預處理后經蛋白酶K消化，利用基因組DNA提取試劑盒(AxyPrep Biosciences，杭州)抽提和純化總DNA。崖沙燕ND2基因的擴增使用引物為ASN(5′-GATCRAGGCCCATCTGTCTAG-3′)和MET-L(5′-AAGCTAT CGGGCCCATACCCG-3′)[14]。PCR反應在50 μL體系中進行，包括2×EasyTaqSuperMix(Transgen，北京)25 μL，正反向引物各1 μL(10 μmol/L)，ddH2O 18 μL，DNA模板5 μL。擴增采用PE-9700型和2400型DNA擴增儀(PE，美國)，反應程序為94℃/3 min；(94℃/30 s，58℃/30 s，72℃/1 min 30 s)30 cycles；72℃/5 min。擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離(80 V穩(wěn)壓、40 min)。憑借紫外燈切下目的條帶，后用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒純化回收，將回收產物送至哈爾濱博仕生物工程技術有限公司，采用原引物進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將每條序列用DNAstar軟件包中的SeqMan進行校對，根據(jù)測序峰圖，舍棄兩端低信號序列，對序列內部位點進行人工校對。在Clustal W上將所得序列進行比對。利用MEGA 5.0[15]計算堿基組成、統(tǒng)計變異位點和遺傳距離等。利用Dnasp 5.0[16]確定單倍型并計算核苷酸多樣性(Nucleotide diversity，Pi)，單倍型多樣性(Haplotype diversity，Hd)及平均核苷酸差異(Average number of nucleotide differences，K)。利用Arlequin 3.0[17]的分子變異分析AMOVA(Analysis of Molecular Variance)估算種群間/內的遺傳分化指數(shù)(FST)。

根據(jù)Pavlova和Alexandra劃分的地理格局將崖沙燕3個亞種分為6個地理種群：東北亞種分成東西伯利亞種群和遠東種群；指名亞種分成歐洲種群、北美種群以及西西伯利亞種群；埃及亞種為以色列種群[7-8]。利用Mrmodeltest 2.3[18]根據(jù)AIC(Akaike Information Criterion)選擇最佳核苷酸替代模型(GTR+G)，基于該模型在MrBayes 3.1.2[19]中構建系統(tǒng)發(fā)育樹(BI)，主要參數(shù)包括：將馬爾可夫鏈運行2 000 000代，每100代記錄1次樹，舍棄最先生成的25%的樹，由后驗概率(posterior probabilities，PP)評價其置信度。利用iqtree[20]構建ML(Maximum Likelihood)樹，最佳核苷酸替代模型TN+G4，自舉檢驗值由1 000次重復檢驗獲得。

2 結果

2.1 線粒體ND2基因片段序列特征及遺傳多樣性

實驗測得50條來自中國東北的崖沙燕ND2基因序列，結合GenBank中下載的序列，共計154條ND2基因部分序列(922 bp)。平均堿基組成為：22.7%T、35.9%C、31.2%A、10.2%G，A+T含量(53.9%)略高于C+G含量(46.1%)，結果與其他脊椎動物mtDNA堿基組成特點一致[21]。在922 bp中包含66個變異位點(7.16%)，其中23個為簡約信息位點，43個為單突變位點。序列轉換顛換比為19.75，沒有出現(xiàn)堿基插入/缺失現(xiàn)象。

崖沙燕各亞種種群及總體單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)及平均核苷酸差異(K)等信息見表2?？傮w的單倍型多樣性為(0.885±0.019)，核苷酸多樣性為(0.002 92±0.000 18)，平均核苷酸差異為2.692。其中單倍型多樣性最高為埃及亞種(0.905)，最低為東北亞種(0.776)。核苷酸多樣性最高為埃及亞種(0.003 41)，最低為東北亞種(0.002 38)。通過Tajima’sD值檢測東北亞種及指名亞種種群差異極顯著P<0.01，拒絕零假設，表明進化不遵循中性模型，發(fā)生過種群擴張。

表2 崖沙燕3個亞種ND2遺傳多樣性

Tab.2 Riparia riparia 3 subspecies genetic diversity based on ND2 gene

注：*代表差異極顯著P<0.01

Note：* Represents that the difference is extremely significant(P<0.01)

2.2 單倍型分布與系統(tǒng)發(fā)育分析

50只崖沙燕中定義了18個ND2單倍型，其中11個為新的ND2單倍型序列(H35-36、H38-43、H46-48)，結合GenBank中的104條崖沙燕序列共分為62個單倍型(H1-H62，表1)。在崖沙燕東北亞種與指名亞種中檢測出2個共享單倍型(H4、H25)，埃及亞種與其他兩個亞種間不存在共享單倍型。在62個單倍型中H1出現(xiàn)頻率最高(43/154)，其次是H4(29/154)。

基于最大似然樹(ML)及貝葉斯樹(BI)構建崖沙燕ND2系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，除置信度不同外，兩種樹的拓撲結構大致相同。結果顯示：3個亞種的單倍型交錯分布，亞種間沒有的差異性，同時6個地理種群也沒有形成獨立的分支。其中東北亞種H60、H39與H45；H59與H61；H33與H49；H43與H52；H35與H41，指名亞種H12、H17與H20，埃及亞種H28與H29；H31與H32的親緣關系較近。

2.3 種群間遺傳分化

6個地理種群中崖沙燕ND2基因序列的遺傳變異的分子變異分析(AMOVA)見表3，72.82%的遺傳變異發(fā)生在種群內，而種群間變異占總變異的27.18%，說明變異主要發(fā)生在種群內。各地理種群間的遺傳分化指數(shù)(FST)及遺傳距離的結果見表4。其中，東北亞種的東西伯利亞種群與指名亞種的歐洲種群、北美種群及西西伯利亞種群的FST和埃及亞種的以色列種群與指名亞種中的西西伯利亞種的FST都小于0.2，表明該種群之間的遺傳分化不顯著。同時，各種群間的遺傳距離在0.002—0.005，表明沒有形成中級分化[22]。

3 討論

核苷酸多樣性(Pi)和單倍型多樣性(Hd)是衡量種群遺傳多樣性的兩個重要指標[23]。其中，Pi值考慮了各種在群體中所占的比率，因此更容易反映一個群體的mtDNA的多態(tài)程度[24]，Pi越大群體的多態(tài)程度越高。本研究中崖沙燕整體的Pi值為0.002 9(表2)，小于淡色崖沙燕的Pi值(0.004 2)[8]。

圖1 基于ND2基因單倍型構建的崖沙燕系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of Riparia riparia based on haplotype sequence variation of partial ND2 sequences 注：分支上的數(shù)字分別表示ML樹的自舉值和BI樹的后驗概率(低于60%的數(shù)值沒有顯示)；淡色崖沙燕作為外群；黃色線為東北亞種的單倍型、紅色線為指名亞種的單倍型、藍色線為埃及亞種的單倍型、橙色線為東北亞種與指名亞種的共享單倍型；系統(tǒng)發(fā)育樹后方為崖沙燕各地理種群的單倍型分布。紅星表示本次實驗所提取的中國東北地區(qū)崖沙燕單倍型 Note：The numbers on the branch represent the bootstrap value of the ML tree and the posterior probability of the BI tree(the values below 60% are not shown).Riparia diluta is the outgroup.The yellow lines are the haplotypes of R.r.ijimae；the red lines are the haplotypes of R.r.riparia；and the blue lines are the haplotypes of R.r.shelleyi；the orange lines are shared haplotypes of the R.r.ijimae and R.r.riparia.The haplotype distribution of the geographical populations of Riparia riparia is behind the phylogenetic trees.Red stars represent the Riparia riparia haplotypes in Northeast China

表3 崖沙燕不同種群遺傳變異的分子變異分析(AMOVA)

Tab.3 AMOVA analysis of ND2 sequences in different populations of Riparia riparia

表4 崖沙燕種群間的遺傳分化指數(shù)和遺傳距離

Tab.4 Differentiation index(FST)and genetic distance between Riparia riparia populations

這說明崖沙燕的遺傳多樣性處于相對較低的水平。遺傳多樣性越低，該種群對環(huán)境適應的能力就越弱。自20世紀60年代以來崖沙燕遭受過幾次大規(guī)模的種群崩潰(population crashes)事件[25]。歐洲部分國家已經將崖沙燕列入世界自然保護聯(lián)盟的瀕危物種名錄[26]。早期的環(huán)志發(fā)現(xiàn)崖沙燕的重捕率非常低，特別是幼鳥，表明它的生存率可能較低。Edward認為這與棲息地降雨量有很大關系，較大的降雨量不僅降低了成鳥的食物資源豐富度，某種程度上也導致崖沙燕巢洞的崩塌[27]?？梢姉h(huán)境容易影響崖沙燕種群遺傳多樣性水平。為防止崖沙燕種群遺傳多樣性進一步降低，可以通過保護其棲息地來實現(xiàn)。例如西歐、北美的一些國家為崖沙燕制造出人工的懸崖，以方便其筑巢生活[26]。

崖沙燕3個亞種的形態(tài)上存在一些差異，例如：埃及亞種的體型較其他亞種小，東北亞種上咽部無黑斑等[7]。本研究增加了中國東北地區(qū)的崖沙燕樣本，從中發(fā)現(xiàn)了11個新ND2單倍型序列。結合前人發(fā)表的序列，基于最大似然法和貝葉斯法構建的崖沙燕ND2單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。結果表明各地理種群和亞種間都沒有形成有效的獨立分枝，這與Manuel和Alexandra的結果一致[7-8]。根據(jù)遺傳分化指數(shù)與基因流的關系FST=1/(4Nm+1)，Nm小于1，表明群體由于遺傳漂變產生遺傳分化；Nm大于1，基因流水平較高，遺傳分化較小；Nm大于4，則群體間基因流更加充分。從遺傳分化給出的數(shù)據(jù)顯示，同一亞種的不同地理種群間，以及不同亞種的不同種群間大多都有著較高的基因流，這導致了崖沙燕的線粒體基因差異較小。

崖沙燕種群間較高水平的基因流可能與其進化歷史和遷徙行為有關。在末次冰期冰盛期時，西伯利亞的崖沙燕擴散到歐洲，海平面的降低使白令陸橋出現(xiàn)促進北美和歐亞大陸崖沙燕的基因流動。后冰期陸橋消失使遠東與北美之間的基因流關閉[8]，解釋了遠東與北美的FST值(表4)相對較大。其次，崖沙燕是一種長距離遷徙候鳥[28]，有著多樣的遷徙路線[29]，有3個主要的越冬地區(qū)：南美洲，撒哈拉以南的非洲和印度次大陸。其中，西伯利亞及遠東地區(qū)的鳥類會遷徙至印度次大陸，而歐洲的鳥類會遷徙至印度次大陸及撒哈拉沙漠以南的非洲，而北美地區(qū)的鳥會遷徙至南美洲[28]。研究表明來自中歐東歐的崖沙燕廣泛分布于地中海盆地和非洲東部南部，以及撒哈拉沙漠以南的薩赫勒地區(qū)[30]。這說明不同地理種群的崖沙燕有相互重疊的越冬區(qū)。重疊的越冬區(qū)使各地區(qū)之間有著高水平的基因流(東西伯利亞-歐洲、東西伯利亞-西西伯利亞和西西伯利亞-以色列)。埃及亞種與其他兩個亞種之間的FST值較大(表4)，僅歐洲的種群與其基因分化指數(shù)相對較小，說明崖沙燕埃及亞種相對獨立，僅與來自歐洲遷徙到非洲的崖沙燕指名亞種有一定的基因交流[30]。

由于線粒體有母系遺傳的特點，缺乏其他分子標記輔助、單一的ND2基因分析只能初步地反映崖沙燕的種群遺傳結構。對崖沙燕的種群遺傳結構的深度剖析，還需要配合相關遺傳學方面的研究證據(jù)。