何紫薇 張玉林 吳 杰 杜娟娟 楊建發(fā) 楊國(guó)琴

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南省高校獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明，650201；2.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，昆明，650201；3.滇西科技師范學(xué)院，臨滄，677000)

瘧疾(Malaria)是由瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumspp.)經(jīng)按蚊傳播引起的一種世界性分布、對(duì)人危害極為嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)病，已成為全球廣泛關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。瘧原蟲(chóng)種類(lèi)較多，已知約150種，主要寄生于人和哺乳動(dòng)物，少數(shù)寄生于鳥(niǎo)類(lèi)和爬行動(dòng)物[1]。寄生于人體的瘧原蟲(chóng)主要有4種，即惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum)、間日瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumvivax)、卵形瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumovale)和三日瘧原蟲(chóng)(Plasmodiummalariae)，它們分別導(dǎo)致惡性瘧疾、間日瘧疾、卵形瘧疾和三日瘧疾[2]。在4種瘧疾寄生蟲(chóng)中，間日瘧原蟲(chóng)的地理分布最為廣泛，在亞洲、中美洲和南美洲、中東、大洋洲和東非都有間日瘧流行[3-4]。2015年全球間日瘧病例約138萬(wàn)例，占全球瘧疾病例總數(shù)的25%—40%[5]，間日瘧原蟲(chóng)是第二大瘧疾流行物種，因此間日瘧原蟲(chóng)很可能成為瘧疾的主要威脅[6]。

云南由于特殊的地域和氣候特點(diǎn)，成為了我國(guó)瘧疾流行地區(qū)之一。有調(diào)查表明，云南間日瘧原蟲(chóng)IgG抗體血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果中女性為9.98%，男性為10.79%[7]。

猴通常作為人類(lèi)疾病的模型動(dòng)物，關(guān)于非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間日瘧原蟲(chóng)感染情況的流行病學(xué)調(diào)查在云南地區(qū)尚未報(bào)道[8-9]。本調(diào)查對(duì)象主要包括恒河猴(Macacamulatta)、豚尾猴(Macacanemestrina)和食蟹猴(Macacafascicularis)3種實(shí)驗(yàn)猴。通過(guò)采集猴血液為樣本進(jìn)行ELISA檢測(cè)，初步了解該研究中心實(shí)驗(yàn)猴間日瘧原蟲(chóng)感染情況，為獼猴屬動(dòng)物或其他非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間日瘧原蟲(chóng)病的防治提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

恒河猴、豚尾猴、食蟹猴3種實(shí)驗(yàn)獼猴血清均于2017年11月至2018年5月采自云南省昆明市某靈長(zhǎng)類(lèi)研究中心(216只單籠飼養(yǎng)，277只群體飼養(yǎng))。

1.1.2 主要試劑

猴間日瘧原蟲(chóng)(PLV)ELISA試劑盒，購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(MLBIO Biotechnology Co.，Ltd，Shanghai，China)，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均來(lái)自于該試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

采用靜脈采血的方法，每管采集3—4 mL前肢靜脈血至肝素納抗凝采血管，反復(fù)顛倒混勻，4℃保存。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，將采集到的血液血清分離，3 000 r/min離心5 min，分別得到的有效血清樣品有恒河猴血清319份，豚尾猴血清89份，食蟹猴血清85份，共獲得493份血清樣品。

1.2.2 間日瘧原蟲(chóng)酶聯(lián)免疫分析

參照猴間日瘧原蟲(chóng)(PLV)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，應(yīng)用雙抗體夾心法檢測(cè)猴血清樣本中的間日瘧原蟲(chóng)抗原。計(jì)算和結(jié)果判定：只有當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00，陰性對(duì)照平均值≤0.10時(shí)為有效試驗(yàn)，才可對(duì)待測(cè)血清結(jié)果進(jìn)行判定。臨界值(CUT OFF)計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15。判定待檢測(cè)血清樣品，OD值<臨界值為間日瘧原蟲(chóng)陰性，OD≥值臨界值為間日瘧原蟲(chóng)陽(yáng)性。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗(yàn)分析獼猴不同品種，性別和年齡間在間日瘧原蟲(chóng)感染情況上的差異，并對(duì)獼猴感染間日瘧原蟲(chóng)風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種獼猴感染間日瘧原蟲(chóng)的血清陽(yáng)性率

本次調(diào)查樣品均來(lái)自云南昆明某靈長(zhǎng)類(lèi)研究中心，共檢測(cè)有效獼猴血清樣本493份。其中，恒河猴319份，ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的有3份，血清陽(yáng)性率為0.94%；豚尾猴89份，ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的有5份，血清陽(yáng)性率為5.62%；食蟹猴85份，檢出率最低為0%，統(tǒng)計(jì)3種獼猴間日瘧原蟲(chóng)血清陽(yáng)性率平均為1.62%(表1)。

表1 不同品種的實(shí)驗(yàn)猴間日瘧原蟲(chóng)感染的血清陽(yáng)性率

Tab.1 Seroprevalence of Plasmodium vivax in different species of experimental monkeys

2.2 不同性別的實(shí)驗(yàn)猴間日瘧原蟲(chóng)感染的血清陽(yáng)性率

從性別上分析，493份猴血清樣本中包括公猴樣本173份，母猴樣本320份。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示公猴感染間日瘧原蟲(chóng)陽(yáng)性樣本有5份，母猴感染間日瘧原蟲(chóng)陽(yáng)性樣本有3份，公猴和母猴的血清陽(yáng)性率分別為2.89%和0.94%(表2)。

表2 不同性別的實(shí)驗(yàn)猴間日瘧原蟲(chóng)感染的血清陽(yáng)性率

Tab.2 Seroprevalence of Plasmodium vivax in different sexes of experimental monkeys

2.3 不同年齡的實(shí)驗(yàn)猴間日瘧原蟲(chóng)感染的血清陽(yáng)性率

從年齡上分析，493份血清樣本中包括了1—24歲不同年齡段的實(shí)驗(yàn)猴，其中青年猴(≤4歲)樣本有261份，成年猴(>4歲)樣本有232份。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，青年猴感染間日瘧原蟲(chóng)陽(yáng)性樣本有8份，血清陽(yáng)性率為3.07%，而在成年猴里沒(méi)有發(fā)現(xiàn)間日瘧原蟲(chóng)感染(表3)。

表3 不同年齡的實(shí)驗(yàn)猴間日瘧原蟲(chóng)感染的血清陽(yáng)性率

Tab.3 Seroprevalence of Plasmodium vivax in different ages of experimental monkeys

2.4 不同品種、性別和年齡的實(shí)驗(yàn)猴感染間日瘧原蟲(chóng)的差異分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用卡方檢驗(yàn)分析不同品種，性別和年齡的實(shí)驗(yàn)猴在間日瘧原蟲(chóng)感染情況上的差異。結(jié)果表明，不同品種的實(shí)驗(yàn)猴感染間日瘧原蟲(chóng)的血清陽(yáng)性率不同，存在顯著差異(χ2=11.213，P<0.05)；不同性別的實(shí)驗(yàn)猴感染間日瘧原蟲(chóng)的血清陽(yáng)性率不存在顯著差異(χ2=2.682，P>0.05)；而不同年齡的實(shí)驗(yàn)猴感染間日瘧原蟲(chóng)的血清陽(yáng)性率不同，存在顯著差異(χ2=7.228，P<0.05)(表4)。

表4 實(shí)驗(yàn)猴不同品種、性別和年齡感染間日瘧原蟲(chóng)χ2檢驗(yàn)結(jié)果

Tab.4 Results of χ2 test of Plasmodium vivax in different varieties，sexes and ages of experimental monkeys

2.5 實(shí)驗(yàn)猴間日瘧原蟲(chóng)感染風(fēng)險(xiǎn)分析

本實(shí)驗(yàn)對(duì)云南昆明某靈長(zhǎng)類(lèi)研究中心實(shí)驗(yàn)猴間日瘧原蟲(chóng)感染風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行了多元邏輯回歸分析，將是否感染間日瘧原蟲(chóng)作為因變量，品種、性別、年齡3個(gè)因素作為自變量，但由上述卡方檢驗(yàn)結(jié)果(表4)已得出，實(shí)驗(yàn)猴的性別差異不顯著(P>0.05)，不必進(jìn)行邏輯回歸分析。簡(jiǎn)單從血清陽(yáng)性率來(lái)看，青年猴(3.07%)感染間日瘧原蟲(chóng)的風(fēng)險(xiǎn)要明顯大于成年猴(0%)；從回歸分析結(jié)果來(lái)看，品種因素是引起實(shí)驗(yàn)猴感染間日瘧原蟲(chóng)的主要風(fēng)險(xiǎn)因子(P=0.004<0.05)。以恒河猴為參考，豚尾猴(OR=6.270，95%CI=1.469-26.770，P=0.047<0.05)更易感染間日瘧原蟲(chóng)病。而食蟹猴感染間日瘧原蟲(chóng)的風(fēng)險(xiǎn)要低于恒河猴(P=0.084>0.05)(表5)。

表5 實(shí)驗(yàn)猴間日瘧原蟲(chóng)感染風(fēng)險(xiǎn)多元邏輯回歸分析結(jié)果

Tab.5 Results of logistics regression analysis of the risk of infection of Plasmodium vivax in experimental monkeys

3 討論

3.1 不同品種和年齡的實(shí)驗(yàn)猴間日瘧原蟲(chóng)感染差異性原因分析

獼猴屬(Macaca)動(dòng)物作為醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究領(lǐng)域中日益廣泛使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，寄生蟲(chóng)的感染不僅影響動(dòng)物的飼養(yǎng)繁殖以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)工作，而且直接關(guān)系到科學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確獲得[10]，此外，間日瘧原蟲(chóng)為人猴共患寄生蟲(chóng)。雖然人和動(dòng)物的瘧原蟲(chóng)一般不發(fā)生交叉感染，即人的瘧原蟲(chóng)不感染動(dòng)物，動(dòng)物的瘧原蟲(chóng)也不感染人。但在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)偶有例外，曾出現(xiàn)寄生于猴、黑猩猩(Pantroglodytes)的瘧原蟲(chóng)感染人，三日瘧原蟲(chóng)感染黑猩猩和夜猴(Aotustrivirgatus)[11]。因此對(duì)實(shí)驗(yàn)猴感染間日瘧原蟲(chóng)的血清學(xué)調(diào)查對(duì)相關(guān)的工作員和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)說(shuō)都具有十分重要的公共衛(wèi)生意義。

本次血清學(xué)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，493份實(shí)驗(yàn)猴血清樣本中判定出有8份為間日瘧原蟲(chóng)抗原陽(yáng)性，血清陽(yáng)性率約為1.62%，造成感染的原因跟實(shí)驗(yàn)猴的來(lái)源和飼養(yǎng)環(huán)境有很大的關(guān)系。據(jù)了解，該靈長(zhǎng)類(lèi)研究中心飼養(yǎng)的猴大部分都是自繁殖而來(lái)，每年投喂2次伊維菌素，實(shí)驗(yàn)猴的飼養(yǎng)環(huán)境主要是平房式猴舍(三面墻一面鐵欄朝外)，通風(fēng)條件較好。猴舍周?chē)谴笃萜汉途G植，背面靠山，環(huán)境優(yōu)美，但由于飼養(yǎng)環(huán)境地處于山林周?chē)⑶揖o挨著一條排水溝，一到秋夏季節(jié)蚊蟲(chóng)較多的時(shí)候，便為其提供了一個(gè)較好的滋生環(huán)境。猴舍四周也沒(méi)有專(zhuān)用的防蚊裝置，因此就增加了攜帶有間日瘧原蟲(chóng)的蚊蟲(chóng)傳播病原的機(jī)會(huì)。

不同品種和年齡的實(shí)驗(yàn)猴感染間日瘧原蟲(chóng)的血清陽(yáng)性率存在顯著差異。其中豚尾猴的血清陽(yáng)性率最高，食蟹猴中則無(wú)間日瘧原蟲(chóng)感染。青年猴的血清陽(yáng)性率也明顯高于成年猴。這種差異的出現(xiàn)可能與不同品種實(shí)驗(yàn)猴的生活習(xí)性不同或是體質(zhì)差異有關(guān)，也可能隨著年齡的增長(zhǎng)，成年猴自身免疫力相對(duì)較強(qiáng)，對(duì)間日瘧原蟲(chóng)的抵抗力也逐漸增強(qiáng)，相對(duì)于4歲及以下的幼年和青年猴，成年猴感染間日瘧原蟲(chóng)的風(fēng)險(xiǎn)更低。從飼養(yǎng)管理的角度來(lái)看，分為單籠飼養(yǎng)和群體飼養(yǎng)兩種方式，不難發(fā)現(xiàn)在這8只感染間日瘧原蟲(chóng)的陽(yáng)性猴中，有6只都是單籠飼養(yǎng)，其余2只群體飼養(yǎng)，日常飼料都是以自制蒸糕為主。由于單籠飼養(yǎng)的猴活動(dòng)范圍受限，靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)更容易招引蚊蟲(chóng)的叮咬，而群養(yǎng)的猴活動(dòng)范圍比較寬闊，整體也更為活躍，不太容易吸引蚊蟲(chóng)。由此我們可以懷疑，差異的出現(xiàn)也可能是由于飼養(yǎng)管理的不同所導(dǎo)致。

感染間日瘧原蟲(chóng)的8只猴并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的間日瘧疾臨床癥狀，間日瘧原蟲(chóng)在人和動(dòng)物體內(nèi)的存活時(shí)間通常為2年，部分可長(zhǎng)達(dá)5年[12]。而猴在感染瘧原蟲(chóng)后，通常要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間才表現(xiàn)出臨床癥狀[13]，這8只猴很有可能是輕度感染者，可成為帶蟲(chóng)者而無(wú)明顯的臨床癥狀，同時(shí)也是潛在的內(nèi)部感染源[14]，應(yīng)引起飼養(yǎng)人員的重視，重點(diǎn)觀察這8只猴的日常精神狀態(tài)，并與其他猴隔離飼養(yǎng)。

3.2 當(dāng)前感染風(fēng)險(xiǎn)分析及防治建議

由間日瘧原蟲(chóng)感染引起的疾病問(wèn)題往往容易被人忽視，曾有調(diào)查顯示，這種寄生蟲(chóng)每年導(dǎo)致大約1億—3億個(gè)臨床病例[15]。在非洲以外，間日瘧原蟲(chóng)占所有瘧疾病例的50%，由于間日瘧原蟲(chóng)流行的大多數(shù)地區(qū)瘧疾傳播率較低，受影響的人群對(duì)該寄生蟲(chóng)的免疫力很弱[16]，該問(wèn)題在實(shí)驗(yàn)猴身上同樣也不可忽視。對(duì)于日常飼養(yǎng)管理實(shí)驗(yàn)猴的工作人員來(lái)說(shuō)，并不是沒(méi)有感染的可能。帶蟲(chóng)的猴都會(huì)成為潛在的內(nèi)部感染源，叮咬了帶蟲(chóng)猴的蚊子再次叮咬人后，便會(huì)把子孢子順理成章地注入到人體內(nèi)，入侵肝臟細(xì)胞，對(duì)人體健康造成危害。早期國(guó)內(nèi)就有研究者采用薄片法，取猴外周血制成血膜薄片，用吉姆薩染色并在高倍鏡下觀察到猴瘧原蟲(chóng)感染。血片中常見(jiàn)裂殖體和配子體時(shí)期，多見(jiàn)于我國(guó)豚尾猴中，恒河猴中亦有發(fā)現(xiàn)[17-18]。猴感染瘧原蟲(chóng)后會(huì)出現(xiàn)厭食，反應(yīng)遲鈍，體質(zhì)消瘦，面色蒼白，有時(shí)還伴有猴血尿[19]。對(duì)此我們應(yīng)引起重視，并提醒從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育工作或是動(dòng)物園的飼養(yǎng)人員，制定一套科學(xué)健康的飼養(yǎng)管理方案，加強(qiáng)間日瘧原蟲(chóng)的防治工作?？稍诤锷岚惭b紗門(mén)、紗窗等，以減少蚊子對(duì)實(shí)驗(yàn)猴的叮咬，并適時(shí)安排驅(qū)蟲(chóng)，提高實(shí)驗(yàn)猴質(zhì)量。工作人員自身也要做好相應(yīng)的防蚊工作，比如使用蚊帳、點(diǎn)驅(qū)蚊藥片或蚊香，在身體外露部分涂抹驅(qū)蚊膏。最后做好綜合防制，保持猴舍和人員居住區(qū)周?chē)h(huán)境的干凈整潔，疏通積水，在下水道經(jīng)常噴殺蟲(chóng)藥，以消滅蚊蟲(chóng)滋生環(huán)境。