孫翠， 王 鈺， 李闊闊， 陳達偉

(安徽大學 資源與環(huán)境工程學院， 合肥 230601)

蛹蟲草Codycepsmilitaris(L.) Link又名北冬蟲夏草，是蟲草屬真菌的模式菌種[1-2]，能夠產(chǎn)生蟲草素、蟲草酸、腺苷等次生代謝產(chǎn)物[3-4]。其中，蟲草素是1950年Cunninghamk等人從蛹蟲草的培養(yǎng)濾液中分離得到的，是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗菌素[5]，具有抗腫瘤[6-7]、抗菌和提高免疫[8-9]等作用，近年來受到廣泛重視。但化學合成難度大，因此在市場上的蟲草素價格很高。蟲草素主要是從蛹蟲草菌株得到的次生代謝產(chǎn)物，因具有與冬蟲夏草藥理相似性被廣泛應(yīng)用[10]。最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草子實體生長周期長，產(chǎn)量低，很難滿足臨床使用[11]。

因此，如何提高蛹蟲草中蟲草素含量成為研究重點。Sari等[12]通過培養(yǎng)基的優(yōu)化篩選高產(chǎn)蟲草素菌株，而誘變育種是提高菌種產(chǎn)量和性能的主要途徑，因其操作簡單，正突變能力強，遺傳穩(wěn)定性高[13]等優(yōu)點故被很多研究者所青睞?；艟安ǖ萚14]對蛹蟲草誘變，選育1株高產(chǎn)菌株H4025；王亮等[15]利用超聲波和硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理，將蛹蟲草的蟲草素產(chǎn)量分別提高了33.5%和103.5%。

本文以蟲草素含量為指標，采用60Coγ射線與紫外復(fù)合誘變的方式對蛹蟲草進行處理以此來提高蟲草素的含量，并通過響應(yīng)面分析法研究固態(tài)發(fā)酵過程中各工藝條件對蛹蟲草生產(chǎn)蟲草素的影響，最終得到固態(tài)發(fā)酵條件的最優(yōu)組合。并為獲得高產(chǎn)蟲草素菌株提供參考方法和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種：蛹蟲草C-8，于4℃冰箱中保存。

1.1.2 試劑和儀器

蟲草素標品，中國藥品生物制品檢定所；高效液相色譜儀，Waters;60Coγ射線誘變設(shè)備，中科院合肥物質(zhì)科學研究院提供；恒溫恒濕箱，寧波江南儀器廠; 水浴鍋，上海醫(yī)療器械五廠; SCQ-2201 超聲波清洗機，中國聲彥超生設(shè)備公司; 電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司。臺式高速冷凍離心機：18R型，力康發(fā)展有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g)：馬鈴薯200、葡萄糖20、 KH2PO41，酵母粉2，MgSO41,瓊脂20，pH 6，蒸餾水定容至1 L。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(g): 葡萄糖20，瓊脂20，KH2PO41，酵母粉2，MgSO41,馬鈴薯汁、大米作為基質(zhì)。

1.2 方法

1.2.1 蟲草素測定[16]

液相色譜條件：色譜柱Agilent 5TC-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm);檢測波長260 nm，流速1.0 mL/min;梯度洗脫流動相比例為純水∶甲醇(85∶15)進樣量10 μL,柱溫保持在30℃。

標準曲線：稱取10 mg標準品，流動相溶解定容至100 mL,溶解于溶液中，配制成100 μg/mL溶液。分別吸取2、4、6、8及10 mL溶液于10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為20、40、60、80和100 μg/mL的標準液。標準曲線y=8E+06x-40 646(R2=0.997)。其中R2=0.997，代表質(zhì)量濃度(mg/g);y代表峰面積。

提取方法：蛹蟲草發(fā)酵米于60℃烘干至恒重，磨碎過100目篩。稱取0.1 g于10 mL容量瓶中，加入10 mL蒸餾水超聲30 min，10 000 r/min離心5 min。取上清用0.45 μm有機微孔濾膜過濾。

1.2.2 誘變育種

1)蛹蟲草60Coγ誘變。活化菌株C-8，培養(yǎng)至12 h,離心取菌體，生理鹽水溶解菌體并稀釋，搖床震蕩1 h，使菌體完全分散，制成單孢子菌液，涂布在平板上，利用原子能放射儀分別以50、100、150和200 Gy的輻照劑量進行誘變處理。然后涂平板，每組做3個重復(fù)，于25℃培養(yǎng)形成單菌落，計算致死率。

2)復(fù)合誘變。選取經(jīng)60Coγ誘變后蟲草素達到最高的突變菌株作為出發(fā)菌株，制備菌懸液，打開紫外燈(25W)約30 cm處，分別進行照射20、40、60、80、100及120 s。取經(jīng)紫外誘變照射后的菌液涂布平板，每組做3個重復(fù)，于25℃培養(yǎng)形成單菌落，計算致死率。

3)計算誘變菌株的致死率。

致死率(%)=(對照菌落數(shù)-處理菌落數(shù))/對照菌落數(shù)×100%

(1)

正突變率(%)=(蟲草素產(chǎn)量高于出發(fā)菌株數(shù)/誘變存活菌株數(shù)) ×100%

(2)

1.2.3 復(fù)合誘變篩選出菌株的蟲草素產(chǎn)量

蛹蟲草進行60Coγ-UV復(fù)合誘變后的發(fā)酵菌絲體進行60℃烘干，過100目篩后進行蟲草素含量檢測，篩選蟲草素產(chǎn)量較高的菌株。

1.2.4 高產(chǎn)蟲草素菌株篩選

以5%的量接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃條件下發(fā)酵28 d。檢測發(fā)酵產(chǎn)物中蟲草素含量。對高產(chǎn)菌株進行傳代培養(yǎng)并檢測連續(xù)傳代12次的蟲草素產(chǎn)量，分析遺傳穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

運用Design Expert 8.0.6軟件對蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵篩選高產(chǎn)蟲草素試驗結(jié)果進行進一步的回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合誘變

2.1.160Coγ誘變劑量的確定

由圖1可知，蛹蟲草菌株致死率隨著60Coγ輻射劑量的增加而提高，200 Gy時致死率達到98.3%。正突變率在輻射強度較低的情況下不斷地增大，100 Gy時達到最大，為19.1%，此時致死率為83.2%。而只有當致死率在70%～80%時[17]所得到的菌株才是可以滿足篩選需求。因此采用60Coγ劑量為100 Gy進行誘變處理。

圖1 60COγ輻射對菌株致死率及正突變率的影響

2.1.260Coγ射線復(fù)合紫外誘變劑量的確定

如圖2 所示，隨著紫外照射時間延長致死率緩慢增加，120 s時，致死率達到95.3%。當紫外線處理時間為80 s時，致死率為81.45%，正突變率達到最大值28.7%。因此，本實驗選擇80 s作為紫外誘變時間。

圖2 60COγ輻射復(fù)合紫外對菌株致死率及正突變率的影響

2.1.3 復(fù)合誘變篩選出菌株的蟲草素產(chǎn)量

對蛹蟲草進行60Coγ-UV復(fù)合誘變，選擇60Coγ誘變劑量為100 Gy與紫外照射時間為80 s，對誘變后得到的31株突變株進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)28 d后，采用HPLC法對發(fā)酵產(chǎn)物中的蟲草素進行定量檢測。得到C1-7蟲草素的產(chǎn)量為7.376 mg/g,而相同發(fā)酵條件下出發(fā)菌株的蟲草素產(chǎn)量僅為4.12 mg/g(圖3)。

圖3 誘變菌株蟲草素產(chǎn)量

圖4 誘變菌株C1-7遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.1.4C1-7遺傳穩(wěn)定性

將通過復(fù)合誘變篩選得到的菌株C1-7進行連續(xù)培養(yǎng)至12代，檢測1、3、6、9及12代發(fā)酵產(chǎn)物中蟲草素含量。發(fā)現(xiàn)傳至12代時，蟲草素產(chǎn)量仍可達7.209 mg/g(圖4)。雖然相對于1代略有下降，但沒有顯著性差異，基本保持產(chǎn)量的穩(wěn)定性，說明該誘變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.2 前期溫度對蟲草素產(chǎn)量的影響

從圖5可以看出，蛹蟲草菌絲培養(yǎng)前期適宜溫度為25℃，之后隨著溫度的增加，蟲草素產(chǎn)量達到最高值后急劇下降，當溫度增加至31℃時產(chǎn)量幾乎可以忽略，說明此溫度范圍下蟲草素菌絲體幾乎不生長。

圖5 前期溫度對蟲草素產(chǎn)量的影響

2.3 后期溫度對蟲草素產(chǎn)量的影響

由圖6 可知，后期溫度為21℃時，蟲草素含量達到最大為7.072 mg/g,之后隨著溫度的增加蟲草素含量將不斷的下降，而當后期溫度高于前期溫度25℃時蛹蟲草生長緩慢幾乎不代謝蟲草素。

圖6 后期溫度對蟲草素產(chǎn)量的影響

2.4 初始含水量對蟲草素產(chǎn)量的影響

從圖7可以看出，蟲草素含量隨著初始含水量的增加先增大后減小。65%時，蟲草素含量達到最高；以后隨著初始含水量的增大，蟲草素含量反而降低。最終確定最佳初始含水量為65%。

2.5響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以前期溫度、后期溫度、初始含水量為試驗因素，采用Box-Benhnken中心試驗組合設(shè)計進行蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵最優(yōu)組合的多因素試驗。前期溫度、后期溫度以及初始含水量的水平編碼見表1。

圖7 初始含水量對蟲草素產(chǎn)量的影響

水平因素A前期溫度(℃)B后期溫度(℃)C初始含水量(%)-123196002521651272370

采用Design Expert.8.0.6.1統(tǒng)計分析軟件對蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的試驗結(jié)果進行回歸分析，二次回歸方程：

S=9.44-0.81A-0.77B-0.32C+0.65AB-0.30AC+0.15BC-1.42A2-3.13B2-1.09C2

(3)

式(3)中：S為蟲草素含量；A為前期溫度(℃)；B為后期溫度(℃)；C為初始含水量(%)。

表2 響應(yīng)面法試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

對蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵響應(yīng)面試驗進行方差分析。由表3可知，模型P=0.0005<0.01，失擬項檢驗P=0.1317，P>0.05不顯著，說明該模型擬合程度較好，可用此模型進行預(yù)測與分析。

由表3可知，對蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蟲草素影響的主次順序為后期溫度>初始含水量>前期溫度，其中一次項后期溫度對蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蟲草素影響最為顯著。二次項前期和后期溫度及初始含水量；后期溫度和初始含水量的交互作用有顯著影響(P<0.01)。

表3 回歸模型方差分析

注：*為顯著(P<0.05);**為極顯著(P<0.01)

圖8顯示，前期溫度為25℃時、后期溫度和初始含水量對蟲草素產(chǎn)量的影響。隨著后期溫度和初始含水量的增加，蟲草素產(chǎn)量也隨著增加。而當后期溫度為21℃，初始含水量為65%時，蟲草素的產(chǎn)量隨著因素的增加而逐漸下降，說明后期溫度和初始含水量過高或過低時，均對蟲草素的產(chǎn)量有影響。

圖8 前期溫度為25℃時后期溫度和初始含水量對蟲草素產(chǎn)量的影響

利用回歸方程(3)預(yù)測蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵的最佳條件為:前期溫度24.3℃、后期溫度20.6℃和初始含水量為63.8%。在此條件下，蟲草素的產(chǎn)量為9.686 mg/g?？紤]實際生產(chǎn)和應(yīng)用，最佳干燥條件應(yīng)修正為：前期溫度為24℃、后期溫度為21℃和初始含水量為64%。在此條件下進行3次平行實驗，測得蟲草素含量為9.595 mg/g，與預(yù)測值絕對誤差值僅相差5%。說明此模型合理可靠。

2.6 誘變菌株與出發(fā)菌株子實體參數(shù)的比較

由表4可知，其中C1-7鮮重達到55.74 g，比對照組超出75.78%，蟲草素12.68 mg/g蟲草素含量為12.68 mg/g比出發(fā)菌株提高了100.2%，干重為7.998 g，生物學效率為69.97，說明誘變菌株具有較高的研究價值。

表4 子實體參數(shù)比較Table 4 Comparison of unit energy consumption

3 結(jié)論

本實驗采用60Coγ結(jié)合UV對原始產(chǎn)蟲草素菌株C-8進行復(fù)合誘變得到菌株C1-7,結(jié)果表明C1-7菌株比出發(fā)菌株的蟲草素提高了79%。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman方法對蛹蟲草發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定其最佳固態(tài)發(fā)酵的參數(shù)組合為：前期溫度為24℃、后期溫度為21℃、初始含水量為64%的條件下，誘變菌株C1-7中蟲草素產(chǎn)量提高至9.595 mg/g，比出發(fā)菌株C-8提高132.9%。將蛹蟲草進行栽培試驗得到菌株C1-7子實體中蟲草素含量為12.68 mg/g比菌株C-8提高了100.2%。該試驗通過復(fù)合誘變和培養(yǎng)基優(yōu)化的方法提高了產(chǎn)蟲草素。但是對蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵目前還處于小試階段，還有待進行大規(guī)模生產(chǎn)。