黃 素,馬丹煒,*,魯 昕,張 紅

1 四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,成都 610101 2 四川出入境檢驗(yàn)檢疫局,成都 610041

化感作用是外來(lái)植物成功入侵的“新式武器”[1]。氣溫、降水、坡向、海拔、經(jīng)緯度等生態(tài)因子對(duì)植物的生理生化特征具有直接或間接的影響[2]。生境的差異會(huì)影響植物次生代謝物質(zhì)的組成和含量,因此,擴(kuò)散到不同地區(qū)的外來(lái)入侵植物其化感作用強(qiáng)度有很大差別[3]。土荊芥(ChenopodiumambrosioidesL.)為藜科藜屬一年生或多年生的芳香性草本植物,原產(chǎn)熱帶美洲,目前已擴(kuò)展我國(guó)絕大多數(shù)地區(qū)。其生命力和傳播能力極強(qiáng),對(duì)環(huán)境有很大的可塑性,能在短期內(nèi)適應(yīng)環(huán)境并占據(jù)生態(tài)位[4]。土荊芥向周?chē)h(huán)境釋放的化感物質(zhì)具有細(xì)胞毒性,導(dǎo)致受體植物的細(xì)胞活性氧水平升高[5],細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞,細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷和遺傳損傷,細(xì)胞活性降低甚至凋亡[6- 8],最終抑制受體植物的生長(zhǎng)[9]。以往對(duì)土荊芥化感作用的研究大多集中于單一特定區(qū)域[5- 9],而對(duì)不同入侵地土荊芥種群之間化感效應(yīng)的差異關(guān)注較少?？状谷A等[10]認(rèn)為,研究不同環(huán)境下植物的化感作用對(duì)全面評(píng)價(jià)其化學(xué)生態(tài)學(xué)行為具有重要意義,只有深入了解不同入侵地土荊芥的化感作用差異,才能更全面的揭示其化感作用機(jī)制。成都和安順?lè)謩e位于四川盆地和云貴高原,兩地的氣候、海拔、地貌等環(huán)境特征差異明顯。本研究室野外考察發(fā)現(xiàn),成都和安順均為受土荊芥危害較為嚴(yán)重的區(qū)域。氣孔保衛(wèi)細(xì)胞是植物響應(yīng)外界刺激的第一門(mén)戶(hù),對(duì)各種脅迫反應(yīng)靈敏,是研究環(huán)境脅迫的經(jīng)典模型系統(tǒng)[11],周健等[6]研究表明,受體保衛(wèi)細(xì)胞對(duì)土荊芥化感脅迫反應(yīng)十分靈敏,保衛(wèi)細(xì)胞功能障礙將直接影響植物的光合作用過(guò)程,抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育。本研究應(yīng)用GC-MS法分別測(cè)定了成都和安順的兩個(gè)土荊芥種群的揮發(fā)油成分及其含量。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了6種農(nóng)作物葉表皮保衛(wèi)細(xì)胞對(duì)土荊芥揮發(fā)物的響應(yīng),并比較分析了兩個(gè)種群化感脅迫效應(yīng)的差異,旨在為深入探討土荊芥的化感作用機(jī)制和入侵機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供體材料土荊芥植株地上部分分別采自四川成都包江橋附近和貴州安順普定火車(chē)站附近,兩個(gè)種群均處于生殖期,長(zhǎng)勢(shì)良好；受體植物蠶豆(ViciafabaL.)、花生(ArachishypogaeaLinn.)、蕎麥(FagopyrumesculentumMoench.)、豌豆(PisumsativumLinn.)和白菜(BrassicacampestrisL.)種子購(gòu)于成都市五塊石種子市場(chǎng),韭(AlliumtuberosumRottl. ex Spreng.)根購(gòu)自成都市龍泉驛區(qū)大面鎮(zhèn)農(nóng)家；α-萜品烯及對(duì)傘花素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自成都市銳可思生化試劑公司；試驗(yàn)用營(yíng)養(yǎng)土購(gòu)自恒奧達(dá)肥料科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油制備和成分測(cè)定

將土荊芥植株地上部分陰干后水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油[12],每1.5 kg蒸餾3 h,無(wú)水Na2SO4干燥置于4℃?zhèn)溆茫徊捎肁glient 7890A/5975c氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法分別測(cè)定兩個(gè)土荊芥種群揮發(fā)油的成分和含量。在此基礎(chǔ)上,對(duì)主要成分α-萜品烯和對(duì)傘花素進(jìn)行單標(biāo)確證。

1.2.2 材料培養(yǎng)及處理

材料培養(yǎng)：選取大小均一、健康的種子,0.5% KMnO4消毒(蠶豆15 min,豌豆、蕎麥、白菜、花生10 min),25℃暗處蒸餾水浸種24 h,催芽2—3 d；挑選萌發(fā)一致的露白種子營(yíng)養(yǎng)土種植(花盆直徑14 cm,高12 cm),25℃光暗周期14 h/10 h培養(yǎng),4周左右隨機(jī)取第二層平展葉片備用；韭根處理方式參照Catola等[13]方法,栽種培養(yǎng)40 d后剪掉葉子,重新長(zhǎng)出的葉用于試驗(yàn),培養(yǎng)條件和其他作物一致。

共設(shè)置8個(gè)處理組,即2個(gè)土荊芥揮發(fā)油處理組(V1,V2),2個(gè)α-萜品烯處理組(T1,T2),2個(gè)對(duì)傘花素處理組(C1,C2),2個(gè)α-萜品烯+對(duì)傘花素混合物處理組(M1,M2)。V1為成都種群揮發(fā)油處理組,根據(jù)成都土荊芥種群揮發(fā)油中α-萜品烯、對(duì)傘花素的含量設(shè)定T1、C1、M1的處理濃度；V2為安順?lè)N群揮發(fā)油處理組,根據(jù)安順土荊芥種群揮發(fā)油中α-萜品烯、對(duì)傘花素的含量設(shè)定T2、C2、M2的處理濃度。二甲基亞砜(DMSO)作助溶劑,配制各處理組母液,其濃度見(jiàn)表1；分別撕取6種農(nóng)作物葉下表皮,切成1 cm×0.5 cm的表皮條,放入裝有5 mL MES緩沖液(0.1 mmol/L CaCl2,50 mmol/L KCl,0.1 mol/L Tris,10 mmol-1MES,pH 7.0)的EP管中,設(shè)置5個(gè)處理梯度,分別取2、4、6、8 μL和10 μL處理母液,用DMSO補(bǔ)足體積10 μL后加入緩沖液,混勻,溶劑對(duì)照組(CK)加入10 μL DMSO。陰性對(duì)照組(0)不加處理液。重復(fù)3次,25℃光照培養(yǎng)30 min。

表1 土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對(duì)傘花素處理母液濃度一覽表

V1：成都種群揮發(fā)油處理,The treatment by volatile oil ofChenopodiumambrosioidesfrom Chengdu；V2：安順?lè)N群揮發(fā)油處理,The treatment by volatile oil ofC.ambrosioidesfrom Anshun；T: α-萜品烯處理,α-terpinene-treated；C: 對(duì)傘花素處理,cymene-treated；M：α-萜品烯+對(duì)傘花素處理,The combined treatment of α-terpinene and cymene；“1”和“2”的處理劑量分別根據(jù)成都種群和安順?lè)N群的揮發(fā)油中相應(yīng)成分的含量確定,The treatment doses of "1" and "2" were determined according to the content of corresponding components in volatile oil ofC.ambrosioidesfrom Chengdu and Anshun, respectively

1.2.3 細(xì)胞活性檢測(cè)

參照馬丹煒等[14]方法。脅迫后,MES緩沖液清洗表皮條3次,AO/EB避光染色3 min,LEICA DM 3000熒光顯微鏡觀(guān)察并拍照。亮綠色熒光的為活細(xì)胞,橘紅色熒光的為死細(xì)胞。每個(gè)處理計(jì)數(shù)1000個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞,重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞死亡率。

1.2.4 細(xì)胞核形態(tài)檢測(cè)

采用Feulgen染色法[14]。脅迫后MES緩沖液清洗表皮條3次,卡諾固定液(無(wú)水乙醇∶冰醋酸=3∶1)4℃固定2 h,1 mol/L鹽酸60℃解離8 min,清洗3次,Schiff試劑避光染色1 h。LEICA DFC450C光學(xué)顯微鏡觀(guān)察并拍照。每個(gè)處理計(jì)數(shù)1000個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞,重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞核畸變率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)Williamson和Richardson[15]提出的化感作用敏感指數(shù)RI用于衡量化感作用強(qiáng)度。

式中,C為對(duì)照值,T為處理值,當(dāng)RI>0時(shí)表示促進(jìn)效應(yīng),當(dāng)RI<0時(shí)為抑制效應(yīng),其絕對(duì)值代表化感作用強(qiáng)度大?。换凶饔镁C合效應(yīng)(SE)為RI的算術(shù)平均值[16]。

使用SPSS 17.00軟件進(jìn)行單因素方差分析,LSD法進(jìn)行多重比較和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩個(gè)入侵地土荊芥種群揮發(fā)油的化學(xué)組成

成都和安順兩個(gè)入侵地的土荊芥植株地上部分揮發(fā)油產(chǎn)率分別為3.173 g/kg和4.820 g/kg。表2可見(jiàn),兩個(gè)種群的揮發(fā)油成分中,含量最高的兩個(gè)成分均為對(duì)傘花素和α-萜品烯。成都種群的揮發(fā)油中共檢出16種化合物,包括萜類(lèi)及其氧化物10種、醇類(lèi)2種、酚類(lèi)1種、酮類(lèi)1種、酯類(lèi)2種；安順?lè)N群的揮發(fā)油中,共檢出25種化合物,包括萜類(lèi)及其氧化物14種、醇類(lèi)5種、酚類(lèi)1種、酮類(lèi)2種、酯類(lèi)3種。兩地土荊芥揮發(fā)油成分的相對(duì)含量差異較大,如α-萜品烯在成都揮發(fā)油中相對(duì)含量為21.07%,安順則高達(dá)42.11%；成都揮發(fā)油的2-蒈烯相對(duì)含量為13.05%,安順僅為3.95%。不同入侵地的土荊芥揮發(fā)油成分具有一定的差異,如成都種群

表2 成都和安順兩地土荊芥揮發(fā)油的化學(xué)成分

中所含的β-蒎烯在安順?lè)N群中未檢出,安順?lè)N群所含α-異松油烯、β-月桂烯、α-松油醇和植酮等在成都種群中沒(méi)有檢測(cè)到。

2.2 不同處理對(duì)6種農(nóng)作物葉保衛(wèi)細(xì)胞活性的影響

觀(guān)察發(fā)現(xiàn),對(duì)照組(CK和梯度0)中6種農(nóng)作物葉保衛(wèi)細(xì)胞的細(xì)胞核大多呈亮綠色熒光,表現(xiàn)出較高的細(xì)胞活性；表3顯示,溶劑對(duì)照組(CK)和陰性對(duì)照組(梯度0)中,6種農(nóng)作物保衛(wèi)細(xì)胞活性無(wú)顯著差異,表明助溶劑DMSO對(duì)葉保衛(wèi)細(xì)胞活性影響不大。

表3 土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯、對(duì)傘花素作用下6種農(nóng)作物保衛(wèi)細(xì)胞的死亡率/%

續(xù)表受體植物Receptor plant處理組Treatment group處理梯度Treatment gradient/(μL/5mL)CK(DMSO)0246810M18.53±0.22a8.15±0.18a21.14±0.21b25.61±0.13c35.15±0.39d45.41±0.74e59.00±1.20fM28.53±0.22a8.15±0.18a33.05±0.29b41.91±0.51c53.20±0.27d71.33±1.08e78.30±0.94f

CK(DMSO)：對(duì)照組(二甲基亞砜),The control group (Dimethyl Sulphoxide)；同一行不同字母表示相同處理下不同劑量差異顯著性(P<0.05)

經(jīng)揮發(fā)油、α-萜品烯、對(duì)傘花素、α-萜品烯+對(duì)傘花素混合物處理后,細(xì)胞核出現(xiàn)橘紅色熒光,說(shuō)明處理液均具有細(xì)胞毒性,導(dǎo)致保衛(wèi)細(xì)胞死亡。表3可見(jiàn),除韭M1組2 μL和蕎麥C2組2 μL處理對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞死亡率無(wú)顯著影響外,大多數(shù)處理中,保衛(wèi)細(xì)胞死亡率均與對(duì)照差異顯著,隨處理濃度增加而增大(P<0.05),在處理劑量為10 μL時(shí)各作物保衛(wèi)細(xì)胞死亡率最高,最高死亡率達(dá)到93.85%。8個(gè)處理組中,蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞死亡率在2、8、10 μL組表現(xiàn)為V2>M2>V1>M1>T2>T1>C1>C2；蠶豆6 μL組,蕎麥2 μL組,豌豆2、4、6 μL組和白菜整體死亡率表現(xiàn)為V2>M2>T2>V1>M1>T1>C1>C2；蠶豆4 μL組,花生2、8 μL組,韭6、8 μL組,蕎麥4、8、10 μL組和豌豆8、10 μL組為V2>V1>M2>T2>M1>T1>C1>C2；花生4、6、10 μL組,韭10 μL組和蕎麥6 μL組表現(xiàn)為V2>V1>M2>M1>T2>T1>C1>C2；韭2、4 μL組為V2>M2>V1>T2>M1>T1>C1>C2。由此可見(jiàn),安順揮發(fā)油毒性效應(yīng)大于成都揮發(fā)油,α-萜品烯毒性大于對(duì)傘花素,混合處理中,α-萜品烯所占比例越高,處理液細(xì)胞毒性越強(qiáng),表明α-萜品烯在土荊芥化感作用中貢獻(xiàn)率較大。此外,揮發(fā)油的化感效應(yīng)大于單一成分的,說(shuō)明除了α-萜品烯和對(duì)傘花素外,揮發(fā)油中還有其他化感物質(zhì),尚待進(jìn)一步挖掘。

2.3 不同處理對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞核形態(tài)的影響

從圖1可見(jiàn),對(duì)照組的保衛(wèi)細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則、均勻完整的分布于保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi),而處理組的保衛(wèi)細(xì)胞核不同程度地出現(xiàn)了各種畸變現(xiàn)象,如核移位、核固縮、核畸形等,說(shuō)明不同入侵地的土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯、對(duì)傘花素、α-萜品烯+對(duì)傘花素混合物處理誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞出現(xiàn)遺傳損傷。

圖1 土荊芥揮發(fā)物作用下保衛(wèi)細(xì)胞核形態(tài)的變化Fig.1 Changes in the nucleus morphology of guard cells exposure to volatiles of Chenopodium ambrosioides L.a, b, c, d, e和f分別是蠶豆、花生、韭、白菜、蕎麥和豌豆的葉保衛(wèi)細(xì)胞,1,2,3,4分別代表正常保衛(wèi)細(xì)胞、核錯(cuò)位、核固縮、核畸形

從表4可知,溶劑對(duì)照組(CK)和陰性對(duì)照組(梯度0)的保衛(wèi)細(xì)胞核畸變率差異不顯著(P>0.05),表明助溶劑對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大；不同處理中,除白菜、豌豆M1組2 μL處理對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞核畸變率沒(méi)有顯著影響外,核畸變率整體表現(xiàn)為隨著處理液濃度增大顯著增加(P<0.05),處理劑量為10 μL的最大核畸變率達(dá)到81.16%。不同處理對(duì)不同作物的遺傳毒性不盡相同,蠶豆2、6 μL組,花生6、8、10 μL組和蕎麥4、6、8 μL組為V2>M2>T2>V1>M1>T1>C1>C2,蠶豆10 μL組,花生4 μL組,韭2、6 μL組,白菜2 μL組和豌豆2 μL組為V2>V1>M2>T2>M1>T1>C1>C2,白菜6、8、10 μL組與豌豆6、8、10 μL組為V2>M2>V1>M1>T2>T1>C1>C2,蠶豆4 μL組,韭8、10 μL組,白菜4 μL組和蕎麥2 μL組為V2>M2>V1>T2>M1>T1>C1>C2,蠶豆8 μL組,花生2 μL組,韭4 μL組,蕎麥10 μL組和豌豆4 μL組為V2>V1>M2>M1>T2>T1>C1>C2。根據(jù)化感綜合效應(yīng)指數(shù)發(fā)現(xiàn),8個(gè)處理組的遺傳毒性表現(xiàn)為V2>M2>V1>T2>M1>T1>C1>C2。這一結(jié)果也說(shuō)明處理液中α-萜品烯比例越大,遺傳毒性越強(qiáng)。與2.2結(jié)果類(lèi)似,揮發(fā)油的化感作用也大于單一成分的,說(shuō)明揮發(fā)油中尚有其他化感物質(zhì)。

表4土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯、對(duì)傘花素作用下6種農(nóng)作物保衛(wèi)細(xì)胞的核畸變率/%

Table4ThenuclearmorphologyabormalrateoftheguardcellsexposedtovolatileoilofChenopodiumambrosioidesL.,α-terpineneandcymene

受體植物Receptor plant處理組Treatment group處理梯度Treatment gradient/ (μL/5mL)CK(DMSO)0246810蠶豆V112.23±0.90a11.41±0.52a17.06±0.49b26.57±0.12c28.37±0.19d36.10±0.31e41.94±0.19fVicia faba L. V212.23±0.90a11.41±0.52a23.68±0.09b33.87±0.90c36.66±0.34d41.69±0.15e48.23±0.16fT112.23±0.90a11.41±0.52a15.16±0.08b18.30±0.07c23.60±0.24d29.57±0.21e33.54±0.20fT212.23±0.90a11.41±0.52a18.73±0.04b25.56±0.27c28.68±0.23d30.47±0.19e38.41±0.04fC112.23±0.90a11.41±0.52a14.49±0.23b15.54±0.10c18.43±0.17d23.42±0.09e25.70±0.07fC212.23±0.90a11.41±0.52a13.41±0.25b14.76±0.15c16.50±0.11d20.70±0.24e24.48±0.16fM112.23±0.90a11.41±0.52a15.79±0.31b20.47±0.28c25.05±0.51d31.92±0.02e37.60±0.17fM212.23±0.90a11.41±0.52a20.36±0.97b30.64±0.37c30.79±0.26c34.95±0.30d40.44±0.11e花生V116.17±0.53a15.75±0.08a22.02±0.26b29.66±0.16c34.34±0.17d46.44±0.12e53.30±0.29fArachis hypogaea Linn.V216.17±0.53a15.75±0.08a24.09±0.04b38.87±0.12c56.96±0.08d64.89±0.03e81.16±0.11fT116.17±0.53a15.75±0.08a17.88±0.04b20.52±0.10c24.88±0.06d32.53±0.10e40.40±0.17fT216.17±0.53a15.75±0.08a18.67±0.14b23.51±0.24c40.51±0.12d48.32±0.16e60.59±0.13fC116.17±0.53a15.75±0.08a17.06±0.02b19.69±0.06c22.81±0.01d25.59±0.21e30.52±0.13fC216.17±0.53a15.75±0.08a16.97±0.01b17.48±0.05b20.82±0.05c24.61±0.02d27.67±0.09eM116.17±0.53a15.75±0.08a18.83±0.01b22.86±0.02c28.37±0.11d38.57±0.13e46.43±0.17fM216.17±0.53a15.75±0.08a19.85±0.07b25.38±0.11c45.35±0.10d53.25±0.08e66.42±0.26f韭V122.65±0.37a21.35±0.78a37.78±0.62b43.18±0.43c48.01±0.35d54.01±1.08e69.78±0.17fAllium tuberosum V222.65±0.37a21.35±0.78a40.07±0.53b44.50±0.12c56.64±0.3570.17±0.94e73.63±0.61fRottl. ex Spreng.T122.65±0.37a21.35±0.78a27.61±0.28b32.35±0.15c35.49±0.16d41.22±0.11e60.49±0.11fT222.65±0.37a21.35±0.78a30.44±0.12b37.39±0.24c39.73±0.20d50.65±0.03e66.59±0.15fC122.65±0.37a21.35±0.78a25.68±0.16b28.62±0.16c31.53±0.12d34.84±0.06e42.64±0.16fC222.65±0.37a21.35±0.78a24.49±0.24b27.44±0.17c30.33±0.16d33.41±0.21e40.57±0.18fM122.65±0.37a21.35±0.78a28.48±0.84b38.56±0.82c39.16±1.37c48.78±0.14d64.85±0.05eM222.65±0.37a21.35±0.78a32.08±1.05b41.75±0.76c42.96±0.35c55.12±0.92d71.22±0.49e白菜V118.77±0.09a18.63±0.12a22.11±0.30b35.81±0.68c40.18±0.09d47.13±0.05e51.04±0.36fBrassica campestris L.V218.77±0.09a18.63±0.12a23.40±0.37b39.84±0.41c43.91±0.42d49.82±0.32e56.87±0.38fT118.77±0.09a18.63±0.12a19.65±0.01b30.57±0.22c32.44±0.13d41.62±0.15e46.50±0.19fT218.77±0.09a18.63±0.12a19.79±0.01b35.43±0.12c39.36±0.19d45.58±0.22e47.96±0.74fC118.77±0.09a18.63±0.12a19.52±0.02b26.38±0.25c28.53±0.04d36.66±0.07e41.34±0.04fC218.77±0.09a18.63±0.12a19.11±0.05b25.56±0.06c27.34±0.05d32.63±0.22e38.50±0.15fM118.77±0.09a18.63±0.12a19.75±0.11a34.03±0.07b39.83±0.13c46.87±0.89d49.35±0.16eM218.77±0.09a18.63±0.12a19.84±0.33a39.10±0.49b41.75±0.10c48.34±1.17d54.00±1.17e蕎麥V120.04±0.13a19.27±0.26a34.44±0.51b40.22±0.55c47.99±0.24d55.63±0.23e72.34±0.18fFagopyrum esculentum V220.04±0.13a19.27±0.26a36.94±0.29b45.41±0.52c53.49±0.36d65.26±0.22e74.57±0.75fMoenchT120.04±0.13a19.27±0.26a29.47±0.10b35.65±0.11c40.39±0.23d49.71±0.06e64.48±0.08fT220.04±0.13a19.27±0.26a33.46±0.16b40.52±0.13c48.63±0.14d56.45±0.07e68.70±0.16fC120.04±0.13a19.27±0.26a26.50±0.22b29.54±0.25c38.36±0.28d45.39±0.42e56.63±0.17fC220.04±0.13a19.27±0.26a25.45±0.22b27.14±0.10c35.69±0.22d39.23±0.06e52.44±0.41fM120.04±0.13a19.27±0.26a32.49±0.41b38.41±0.78c43.43±0.20d51.28±0.06e69.44±0.37fM220.04±0.13a19.27±0.26a35.20±0.09b43.78±0.57c51.16±0.31d58.90±0.41e71.52±0.71f豌豆V118.78±1.20a17.62±0.05a23.37±0.41b31.66±0.35c47.27±0.09d57.40±0.24e75.47±0.20fPisum sativum Linn.V218.78±1.20a17.62±0.05a24.53±0.11b34.20±0.92c53.76±1.71d68.84±1.68e80.83±0.18fT118.78±1.20a17.62±0.05a19.74±0.02b25.37±0.17c40.46±0.23d50.63±0.12e65.18±0.10fT218.78±1.20a17.62±0.05a22.71±0.10b27.54±0.27c43.36±0.12d55.44±0.12e71.28±0.01fC118.78±1.20a17.62±0.05a19.35±0.00b23.56±0.15c31.67±0.14d40.75±0.03e43.18±0.08fC218.78±1.20a17.62±0.05a19.26±0.21b21.41±0.27c28.58±0.14d37.40±0.19e39.63±0.27fM118.78±1.20a17.62±0.05a20.14±0.92a29.74±1.04b46.04±0.46c56.72±0.50d74.14±0.99eM218.78±1.20a17.62±0.05a22.86±0.96b30.90±0.52c48.44±0.72d60.18±0.68e78.16±0.94f

2.4 不同處理對(duì)6種農(nóng)作物化感作用強(qiáng)度比較

表5顯示,不同處理的化感作用強(qiáng)度依次為V2>M2>V1>T2>M1>T1>C1>C2,表明α-萜品烯和對(duì)傘花素均對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞有化感作用,α-萜品烯的細(xì)胞毒性強(qiáng)于對(duì)傘花素,α-萜品烯比例越大,化感作用越強(qiáng)。由此推測(cè),α-萜品烯是土荊芥的主效化感物質(zhì)。6種農(nóng)作物保衛(wèi)細(xì)胞對(duì)土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯、對(duì)傘花素、α-萜品烯+對(duì)傘花素混合物的敏感程度由大到小依次為蕎麥、豌豆、蠶豆、韭、花生、白菜。

表5 土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯、對(duì)傘花素化感效應(yīng)比較

3 討論

3.1 不同入侵地土荊芥揮發(fā)油組成成分的差異

海拔、光照、水分、營(yíng)養(yǎng)等生境的差異,往往會(huì)引起同一種植物不同種群之間次生代謝物的差異[17-18],如馬達(dá)加斯加的土荊芥揮發(fā)油主要成分是驅(qū)蛔素(41.8%),對(duì)傘花素(16.2%)、α-萜品烯(9.7%)和檸檬烯(3.8%)[19],尼日利亞的土荊芥揮發(fā)油主要成分是α-萜品烯(63.1%)、對(duì)傘花素(26.4%)和驅(qū)蛔素(3.9%)[20]。本研究結(jié)果表明,兩個(gè)分布于不同環(huán)境條件下的土荊芥種群揮發(fā)油含量差異較大,分別為3.173 g/kg(成都)和4.820 g/kg(安順)。另一方面,兩個(gè)種群的揮發(fā)油化學(xué)成分中,分別檢出了化合物16種(成都)和25種(安順),二者均包括萜類(lèi)及其氧化物、醇類(lèi)、酚類(lèi)、酮類(lèi)和酯類(lèi)等化合物,其中α-萜品烯和對(duì)傘花素為兩個(gè)種群揮發(fā)油的主要成分,但含量差異明顯,在成都種群和安順?lè)N群中,α-萜品烯的含量分別為21.07%和42.11%,對(duì)傘花素的含量分別為25.88%和24.04%；β-蒎烯、α-異松油烯、(+)- 4-蒈烯、β-月桂烯、植酮和左旋-α-蒎烯等僅存在于安順?lè)N群中。由此可見(jiàn),生活在不同環(huán)境條件下的土荊芥種群,其揮發(fā)油的化學(xué)組成及其含量均具有較大的差異。

3.2 不同入侵地土荊芥種群化感效應(yīng)的差異

許多入侵植物釋放的化感物質(zhì)如萜類(lèi)、生物堿、醌類(lèi)等均具有明顯的細(xì)胞毒性,如桉(EucalyptusrobustaSmith)的揮發(fā)油及其單萜烴類(lèi)揮發(fā)物引起萵苣(LactucasativaL.)根尖分生組織細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)顯著降低,細(xì)胞核發(fā)生核固縮,染色體變異[21]；萘醌擾亂受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和代謝酶活性,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[22]；紫莖澤蘭(EupatoriumadenophorumSpreng．)的兩種倍半萜化感物質(zhì)DTD和HHO導(dǎo)致稻谷(OryzasativaL.)根尖細(xì)胞形狀和排列不規(guī)則,變得干癟,細(xì)胞核裂解,細(xì)胞質(zhì)變少,高爾基體、核糖體和線(xiàn)粒體數(shù)量下降等現(xiàn)象[23]；本研究結(jié)果表明土荊芥揮發(fā)物具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性,雖然不同作物保衛(wèi)細(xì)胞對(duì)土荊芥揮發(fā)物的敏感程度存在一定的差異,但都不同程度地受到損傷,如核固縮、核降解、核錯(cuò)位、細(xì)胞活性降低甚至死亡,細(xì)胞死亡率和畸變率與濃度呈正相關(guān)。比較土荊芥揮發(fā)油主要成分的細(xì)胞毒性發(fā)現(xiàn),α-萜品烯的細(xì)胞毒性大于對(duì)傘花素,這一結(jié)果與本研究室前期研究結(jié)果一致[6- 8]。此外,本研究發(fā)現(xiàn),土荊芥揮發(fā)物中α-萜品烯所占比例越高,細(xì)胞毒性越強(qiáng),這在一定程度上說(shuō)明α-萜品烯在土荊芥的化感作用中起著重要作用。

環(huán)境條件的差異可能導(dǎo)致不同地區(qū)的同種植物次生代謝產(chǎn)物發(fā)生變化,從而表現(xiàn)出化感作用差異[24]。為了提高自身在逆境中的生存能力,植物會(huì)以釋放更多化感物質(zhì)的方式抑制周?chē)参锏纳L(zhǎng)[25-26],與此相反的是環(huán)境條件較為優(yōu)越時(shí)植物產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)較少[27]。安順市大部分地區(qū)屬于喀斯特地貌,海拔高度在1300—1400 m之間,日照充沛,土壤抵抗侵蝕的能力較差,生態(tài)環(huán)境比較脆弱[28],干旱是其主要的氣象災(zāi)害之一[29]；而成都市海拔較低(供試植株采集地海拔450 m),屬于亞熱帶季風(fēng)氣候,水熱條件充沛[30],環(huán)境條件相對(duì)優(yōu)越。本研究結(jié)果顯示,安順?lè)N群揮發(fā)油的含量大于成都種群,而且從安順?lè)N群的揮發(fā)油檢出的成分(25種)比成都種群的成分(16種)豐富,化感效應(yīng)較強(qiáng)的α-萜品烯含量(42.11%)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于成都植株中的含量(21.07%)。由此推測(cè),擴(kuò)散到環(huán)境條件相對(duì)較差的土荊芥種群,為了取得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),向周?chē)h(huán)境釋放化感物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量都有所增加,且毒性較強(qiáng)的化感物質(zhì)比例增大。

4 結(jié)論

土荊芥揮發(fā)物具有較大的細(xì)胞毒性,導(dǎo)致保衛(wèi)細(xì)胞活性降低,細(xì)胞核出現(xiàn)核移位、核固縮、核畸形等畸變特征。隨著處理濃度增加,保衛(wèi)細(xì)胞的死亡率和核畸變率增大；不同農(nóng)作物保衛(wèi)細(xì)胞對(duì)土荊芥揮發(fā)物脅迫的敏感程度不同；不同入侵地的土荊芥揮發(fā)油成分和含量差異較大,環(huán)境條件較差時(shí),土荊芥釋放揮發(fā)性物質(zhì)成分較為復(fù)雜,細(xì)胞毒性較大的成分所占比例增加。