洪 朗， 李月舟

(浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 杭州 310058)

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家們對(duì)生物納米技術(shù)的興趣與日俱增。近些年來(lái)在生物納米技術(shù)領(lǐng)域誕生了一些新方法，比如將納米尺度的蛋白分子作為生物傳感器和分子開(kāi)關(guān)，人為控制小分子化合物、特定離子等成分通過(guò)生物膜。目前已有研究使用這些小分子來(lái)參與對(duì)癌癥的診斷和治療。結(jié)合脂質(zhì)體這種人工合成的脂質(zhì)囊泡工具，科學(xué)家們由此提出了一種新的物質(zhì)運(yùn)輸方法：將一種可遠(yuǎn)程操控的蛋白質(zhì)分子開(kāi)關(guān)嵌在脂質(zhì)體上，使得脂質(zhì)體內(nèi)容物可人為操控地釋放或停止釋放。而機(jī)械敏感通道，特別是大電導(dǎo)機(jī)械敏感通道，由于其性質(zhì)穩(wěn)定，易于改造，可調(diào)控性強(qiáng)等特點(diǎn)，是作為這一類(lèi)分子開(kāi)關(guān)最為適合的候選蛋白之一。近些年來(lái)科學(xué)家們對(duì)MscL通道進(jìn)行了很多研究以發(fā)揮其作為生物傳感器和分子開(kāi)關(guān)的潛力，本文旨在對(duì)近年來(lái)MscL通道在生物納米技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展進(jìn)行綜述。

1 納米給藥系統(tǒng)

近些年來(lái)納米技術(shù)的發(fā)展對(duì)癌癥的治療和診斷產(chǎn)生了巨大的推進(jìn)作用[1-2]，而其中最關(guān)鍵最核心的內(nèi)容就是各種納米藥物載體的發(fā)現(xiàn)，這些用作藥物載體的納米微粒直徑在50～400 nm的范圍內(nèi)，能夠方便地抵達(dá)病患處，并在特定的條件下釋放出內(nèi)容物[3]，從而實(shí)現(xiàn)抗癌藥物的定向遞送。這些納米微粒有很多類(lèi)型，包括嵌合了分子開(kāi)關(guān)的脂質(zhì)體，其他還有例如已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中廣泛應(yīng)用的微膠粒聚合物、經(jīng)過(guò)分枝化加工的樹(shù)枝狀大分子。在無(wú)機(jī)納米微粒中，二氧化硅介孔的納米分子、納米鉆石以及納米金分子也可用于藥物配送。此外，還有經(jīng)設(shè)計(jì)的病毒做成的病毒納米分子和穹隆體納米分子這類(lèi)生物源的納米微粒。

由于腫瘤組織包含大量的脈管系統(tǒng)，只有尺寸極小的顆粒才能夠通過(guò)，因此這些納米微?？梢源罅窟M(jìn)入脈管系統(tǒng)，積聚在腫瘤內(nèi)部。除了這種被動(dòng)定位方式之外，也可以通過(guò)在納米微粒表面添加特定的定位信號(hào)，如葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白和RGD等腫瘤細(xì)胞表面受體相應(yīng)的配體或抗體來(lái)主動(dòng)定位[4-6]。

納米給藥系統(tǒng)的另一重要特征是物質(zhì)釋放的可控制性。比如在癌癥的治療中，理想的納米給藥模型是將抗癌藥物包裹在納米微粒內(nèi)部配送到腫瘤處，當(dāng)接收到釋放信號(hào)時(shí)納米微粒會(huì)將內(nèi)部的抗癌藥物釋放出來(lái)。除了抗癌藥物以外，納米給藥系統(tǒng)也可以裝載配送其他的化合物。例如裝載熒光染料來(lái)成像，或是在裝載熒光染料的同時(shí)還裝載藥物來(lái)指導(dǎo)診療的操作[7]。很多刺激因素都可以作為釋放信號(hào)來(lái)使納米微粒釋放內(nèi)容物，例如身體內(nèi)部環(huán)境中的pH和氧化還原狀態(tài)，甚至包括光和磁場(chǎng)刺激。在這個(gè)系統(tǒng)中，確保納米微粒到達(dá)腫瘤之前其內(nèi)容物不能釋放出來(lái)是很重要的。

2 大電導(dǎo)機(jī)械敏感性離子通道

機(jī)械敏感性離子通道(Mechanosensitive channels)是一類(lèi)感知和響應(yīng)膜張力變化的膜蛋白，廣泛存在于各種生物中。機(jī)械敏感性離子通道作為一種可以將機(jī)械刺激轉(zhuǎn)換為電信號(hào)或生化信號(hào)的分子開(kāi)關(guān)，參與聽(tīng)覺(jué)、平衡、觸覺(jué)和疼痛等多種生理和病理活動(dòng)，在骨骼、腎臟和心血管等系統(tǒng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用。失調(diào)的機(jī)械敏感性離子通道涉及多種疾病，例如囊性纖維化[8]、抑郁、癲癇[9-10]，以及高血壓、心律失常、心力衰竭等心血管疾病[11-13]。機(jī)械敏感性離子通道具有獨(dú)特的對(duì)外界刺激的響應(yīng)機(jī)制，而且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，功能穩(wěn)定，通透速度快，特別是大電導(dǎo)的機(jī)械敏感性離子通道(Mechanosensitive channel of large conductance, MscL)電導(dǎo)高達(dá)3.6 nS，通道開(kāi)放形成直徑30?～40?的巨大孔徑[14]。這使得MscL在納米生物感受器方面的應(yīng)用備受關(guān)注。通過(guò)開(kāi)放機(jī)制和功能修飾的研究，我們可以構(gòu)建以修飾后的機(jī)械敏感性離子通道作為分子開(kāi)關(guān)的納米生物傳感器，重組脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，應(yīng)用于定位的藥物釋放，靶向的癌癥治療等。

MscL位于細(xì)胞膜上，在細(xì)胞中起到緊急閥門(mén)的作用：當(dāng)細(xì)胞受到低滲刺激的時(shí)候，通道開(kāi)放釋放出內(nèi)容物，減低滲透差，避免細(xì)胞因?yàn)轶w積的過(guò)度膨脹而破裂[15]。水分子、離子、ATP，甚至一些小的蛋白質(zhì)，都能夠通過(guò)開(kāi)放的MscL通道[16]。MscL 功能穩(wěn)定，可以被表達(dá)純化并重組到人工脂質(zhì)體上并仍具有通道活性[17-18]。MscL結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，具有五聚體的結(jié)構(gòu)，每個(gè)單體包括兩個(gè)跨膜片斷TM1和TM2(transmembrane)，N-端，C-端都位于膜內(nèi)側(cè)并通過(guò)Loop區(qū)域相連。研究表明TM1是構(gòu)成通道孔徑的主要區(qū)域，而TM2則主要和膜脂質(zhì)發(fā)生相互作用并涉及對(duì)膜張力的感應(yīng)[19](圖1)。

A：MscL通道關(guān)閉和開(kāi)放狀態(tài)模型，上半部分是側(cè)面視角，下半部分是周質(zhì)側(cè)視角;B：MscL蛋白一個(gè)單體的結(jié)構(gòu)示意圖，包括N端和C端的一個(gè)螺旋，兩個(gè)跨膜區(qū)域TM1和TM2以及二者之間的周質(zhì)環(huán)

圖1大腸桿菌MscL蛋白的結(jié)構(gòu)模型
Figure 1 One proposed model for the structure of theE.coliMscL protein

3 MscL通道開(kāi)放調(diào)控

3.1 光調(diào)控

在已知的納米裝置中，光控分子開(kāi)關(guān)具有突出地位。由于其響應(yīng)時(shí)間短和能在不同狀態(tài)中迅速、反復(fù)且可逆轉(zhuǎn)換的特性，這些分子開(kāi)關(guān)可以用來(lái)調(diào)控材料的多種性質(zhì)，例如表面濕度、折射指數(shù)、雙分子膜的側(cè)面壓力分布。在分子水平還可以涉及酶的活動(dòng)調(diào)節(jié)[21-22]。

將光開(kāi)關(guān)用于門(mén)控離子通道是當(dāng)前的一個(gè)熱點(diǎn)，特別是在調(diào)控離子通透和藥物釋放方面的應(yīng)用。已有研究對(duì)大腸桿菌的MscL通道蛋白進(jìn)行修飾改造成分子開(kāi)關(guān)，該分子開(kāi)關(guān)可嵌入雙分子膜中，在光的調(diào)控下開(kāi)放或關(guān)閉。

基于MscL通道的光控分子開(kāi)關(guān)研究是在MscL蛋白的G22C突變體的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。MscL蛋白的第22位氨基酸位點(diǎn)位于TM1區(qū)域，在空間結(jié)構(gòu)上處于孔道區(qū)，點(diǎn)突變得到的G22C是功能獲得性突變體，即該突變體通道開(kāi)放所需力的閾值相比于野生型大大降低，可自發(fā)開(kāi)放。野生型MscL通道不含有半胱氨酸，因此具有半胱氨酸選擇性的光控修飾物可以特異性地結(jié)合在G22C突變體的半胱氨酸殘基上。這類(lèi)光控化合物本身不帶電荷，與半胱氨酸結(jié)合后會(huì)改變G22C突變體的功能特性，使孔道區(qū)疏水性增加，使自發(fā)開(kāi)放的G22C突變體通道關(guān)閉。當(dāng)化合物在特定波長(zhǎng)的光照射下，帶電性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化，轉(zhuǎn)變?yōu)閹щ姾蔂顟B(tài)。當(dāng)結(jié)合在G22C突變體上的化合物帶電荷之后，會(huì)破壞孔道區(qū)的疏水性質(zhì)，從而使G22C突變體重回自發(fā)開(kāi)放的性質(zhì)[23]。

碘代乙酸4,5-二甲氧基-2-硝基芐脂是一種光照反應(yīng)不可逆的修飾物。將該化合物修飾于MscL蛋白的G22C突變體上時(shí)，原化合物上的碘原子由半胱氨酸殘基上的巰基基團(tuán)取代，突變體的每一個(gè)單體修飾后通道都會(huì)因孔道區(qū)疏水性上升而關(guān)閉。經(jīng)過(guò)波長(zhǎng)300 nm以上的光照射，該化合物會(huì)發(fā)生裂解反應(yīng)，裂解后仍修飾于半胱氨酸殘基上的殘余部分會(huì)帶負(fù)電荷。由修飾物帶負(fù)電導(dǎo)致的孔道區(qū)親水性上升使得通道可以自發(fā)開(kāi)放(圖2)。

圖2 光照反應(yīng)不可逆修飾物[23]Figure 2 A irreversible modifier

注：該修飾物經(jīng)光照裂解后，修飾在通道上的殘余部分帶電荷

3′,3′-二甲基-1′-(2-羥乙酰碘)-6-硝基螺[2氫-1-苯并吡喃-2,2′-二氫吲哚]是一種光照反應(yīng)可逆的修飾物，同樣可特異性結(jié)合于半胱氨酸殘基上。該化合物有兩種狀態(tài)：不帶電荷的螺吡喃態(tài)和帶電荷的部花青態(tài)。處于螺吡喃態(tài)的化合物在波長(zhǎng)366 nm光照下可轉(zhuǎn)化為部花青態(tài)，而部花青態(tài)在波長(zhǎng)大于460 nm光照下可恢復(fù)為螺吡喃態(tài)。將該化合物修飾于MscL蛋白的G22C突變體上時(shí)，修飾物處于螺吡喃態(tài)則孔道區(qū)疏水，通道關(guān)閉；修飾物處于部花青態(tài)時(shí)則孔道區(qū)親水，通道開(kāi)放(圖3)。因此，通過(guò)不同波長(zhǎng)的光照，可以控制修飾物的帶電性質(zhì)，從而可通過(guò)影響通道孔道區(qū)的親疏水性來(lái)可逆地調(diào)控通道的開(kāi)放或關(guān)閉。

3.2 pH值調(diào)控

在臨床中，癌癥和炎癥組織中往往pH值較低。同光調(diào)控類(lèi)似，已有研究發(fā)現(xiàn)了一系列的半胱氨酸特異性結(jié)合的pH值調(diào)控化合物，這些化合物在不同pH值環(huán)境下會(huì)表現(xiàn)出不同的帶電性質(zhì)：帶正電荷、帶負(fù)電荷或不帶電荷。將這些化合物修飾在MscL蛋白的G22C突變體上，當(dāng)這些pH值調(diào)控化合物不帶電荷時(shí)，并不影響孔道區(qū)疏水性，通道保持關(guān)閉，而當(dāng)這些化合物帶電時(shí)，孔道區(qū)變得親水，使通道開(kāi)放。這樣通過(guò)改變周?chē)h(huán)境的pH值就可以改變通道孔道區(qū)的親疏水性，從而調(diào)控通道的開(kāi)放與關(guān)閉[24-25]。

結(jié)合光調(diào)控和pH值調(diào)控的研究，研究者還發(fā)現(xiàn)了一種特殊化合物可以起到“復(fù)合”調(diào)控的作用。[(4,5-二甲氧基-2-硝基-芐氧羰基)-甲基-氨基]-乙酸2-甲烷磺酰硫基-乙酯具有巰基選擇性，不帶電荷，可修飾在G22C突變體上使通道維持關(guān)閉狀態(tài)，經(jīng)過(guò)366 nm的紫外光照射后，該化合物會(huì)發(fā)生裂解反應(yīng)，裂解后仍修飾在G22C突變體上的殘余部分具有pH值調(diào)控化合物特性，在pH 5.7時(shí)帶正電，在pH 7.7時(shí)恢復(fù)為不帶電狀態(tài)，當(dāng)其帶電荷時(shí)，可以由孔道區(qū)親水性增強(qiáng)的變化使得通道開(kāi)放[26](圖4)。

圖3 光照反應(yīng)可逆修飾物[23]Figure 3 A reversible modifier

注：通過(guò)對(duì)光照波長(zhǎng)的控制，該修飾物可以在帶電荷和不帶電荷的兩種狀態(tài)下自由轉(zhuǎn)換。其中螺吡喃態(tài)不帶電荷，部花青態(tài)帶電荷

圖4 “復(fù)合”調(diào)控型修飾物[26]Figure 4 A "Complex" modifier

注：這種特殊的修飾物經(jīng)光照裂解后，殘余修飾部分具有pH值調(diào)控修飾物的功能，是一種結(jié)合光調(diào)控和pH值調(diào)控的修飾物

3.3 磁力調(diào)控

磁力調(diào)控的設(shè)想源于將脂質(zhì)體類(lèi)的納米給藥系統(tǒng)用于疾病治療的研究。已有研究發(fā)現(xiàn)了一種半徑小于10 nm的具有超順磁性的分子CoFe2O4具有巰基選擇性，可以結(jié)合在MscL蛋白的M42C突變體上。MscL蛋白的第42位氨基酸位于TM1區(qū)域的末端，處于膜外，M42C突變體與野生型相比在功能上沒(méi)有變化。結(jié)合磁性分子CoFe2O4后，在磁場(chǎng)范圍下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在膜片水平上，開(kāi)放的通道增多。在單通道水平上，通道開(kāi)放的機(jī)械力閾值減小。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)了人工合成的通道蛋白分子沒(méi)有細(xì)胞毒性，進(jìn)一步提出了把MscL通道蛋白的磁力調(diào)控用于脂質(zhì)體類(lèi)納米給藥系統(tǒng)應(yīng)用的可能性[27]。

4 通道選擇性調(diào)控

4.1 通道孔徑調(diào)控

除了研究遠(yuǎn)程操控通道開(kāi)放，還有研究致力于調(diào)控通道開(kāi)放時(shí)的孔徑大小。已有研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)MscL蛋白TM2和CB(α helical cytoplasmic terminal bundle)的連接區(qū)域的3種突變可以改變通道開(kāi)放時(shí)的電導(dǎo)大小[17]。CB區(qū)域是指MscL 5個(gè)單體中位于胞質(zhì)側(cè)的C端螺旋的聚合區(qū)域。

第1種突變方式是刪除TM2和CB連接區(qū)域的氨基酸殘基，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相對(duì)于野生型MscL蛋白，Δ110-112突變體開(kāi)放時(shí)的電導(dǎo)輕微下降， Δ110-115突變體開(kāi)放時(shí)的電導(dǎo)明顯下降。實(shí)驗(yàn)還用鈣熒光染色比較了G22C突變體和G22C/Δ110-115突變體對(duì)熒光染料的釋放情況，鈣熒光染料calcein的直徑大小是小于通道孔徑的，因此可以通過(guò)通道。但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鈣熒光染料可以通過(guò)G22C突變體，但不能通過(guò)G22C/Δ110-115突變體，從而得出結(jié)論：刪除TM2和CB連接區(qū)域的氨基酸殘基可以減小MscL蛋白的通道孔徑。

第2種突變方式是把TM2和CB連接區(qū)域的氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，人為地制造二硫鍵形成交聯(lián)。通過(guò)Western Blot發(fā)現(xiàn)存在5條倍數(shù)于單體大小的蛋白條帶，證明二硫鍵交聯(lián)的存在，通過(guò)電生理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A110-112C突變體相對(duì)野生型MscL蛋白電導(dǎo)下降。對(duì)A110-112C突變體使用二硫鍵氧化劑DTT打斷二硫鍵以后電導(dǎo)會(huì)恢復(fù)到野生型MscL水平,表示該過(guò)程可逆。

第3種突變方式是在TM2和CB連接區(qū)域交聯(lián)重金屬離子。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于野生型MscL蛋白，A110H突變體和A112H突變體僅在敏感性方面有所下降，在電導(dǎo)方面的性質(zhì)沒(méi)有變化。而加入ZnCl2后，野生型MscL蛋白電導(dǎo)沒(méi)有變化，A110H突變體和A112H突變體由于Zn2+的存在形成重金屬離子交聯(lián)，使得電導(dǎo)下降。A110H突變體和A112H突變體洗脫ZnCl2后電導(dǎo)復(fù)原。

4.2 通道離子通透能力調(diào)控

MscL通道具有較大的孔徑，沒(méi)有離子選擇性，但已有實(shí)驗(yàn)表明，修飾后的MscL通道對(duì)于不同帶電分子通透性不同。實(shí)驗(yàn)使用兩種具有半胱氨酸特異性的修飾物MTSET和MTSES修飾于MscL蛋白的G26C突變體[28]。第26位氨基酸位于TM1，已被證明是MscL的限制性位點(diǎn)，是MscL通道最窄的位置[29]。當(dāng)MTSET或MTSES結(jié)合在該位點(diǎn)上時(shí)，MTSET帶正電，MTSES帶負(fù)電，使孔道區(qū)帶電。修飾后的G26C突變體會(huì)自發(fā)開(kāi)放。

在膜片鉗實(shí)驗(yàn)中，數(shù)據(jù)表明：對(duì)于琥珀酸鈉，帶負(fù)電的琥珀酸離子相比于野生型通道在MTSET修飾的通道中通透性上升，在MTSES修飾的通道中通透性下降，而鈉離子通透性無(wú)明顯變化。對(duì)于四鹽酸精胺，帶正電的精胺離子在MTSET修飾的通道中通透性下降，在MTSES修飾的通道中通透性上升，而氯離子通透性只有輕微的變化。更多的實(shí)驗(yàn)證明，離子分子量越大，所帶電荷越多，就更易于由修飾后的MscL通道調(diào)控[30]。

5 總結(jié)

MscL通道具有較大的孔道直徑、簡(jiǎn)單穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)、高通透性以及直接響應(yīng)膜張力變化而開(kāi)放等特點(diǎn)，一直以來(lái)被認(rèn)為在納米科技領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景，特別是作為調(diào)控離子通透、釋放小分子化合物和藥物的生物傳感器或分子開(kāi)關(guān)。具有代表性的大腸桿菌MscL是一種同源五聚體蛋白質(zhì)，每個(gè)單體只有136個(gè)氨基酸[31]，是目前從結(jié)構(gòu)和功能上了解得最為透徹的機(jī)械敏感性離子通道，科學(xué)家們也已經(jīng)對(duì)多種大腸桿菌MscL突變體的通道功能性質(zhì)有了深刻認(rèn)識(shí)。

對(duì)MscL通道在應(yīng)用方面的深入研究主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：調(diào)控通道的開(kāi)放因素和調(diào)控通道的選擇性。如前文所述，已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證實(shí)修飾后的MscL通道可以由光、pH值和磁力等因素調(diào)控。特別是光和pH值調(diào)控的研究里，G22突變體調(diào)控開(kāi)放的過(guò)程是可逆的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，相比于G22突變體，G26突變體開(kāi)放狀態(tài)更穩(wěn)定，開(kāi)放規(guī)模更大，是更適合用于修飾改造的突變體[32]。除了這些調(diào)控手段以外，超聲調(diào)控納米分子開(kāi)關(guān)的研究前景也值得期待，相比于光、pH值和磁力這些條件，超聲是對(duì)高等生物活體更適用的刺激方式，可以在不影響機(jī)體其他生命活動(dòng)的前提下直接對(duì)體內(nèi)部位給予無(wú)損刺激，調(diào)控位于體內(nèi)的分子開(kāi)關(guān)[33]。此外過(guò)去也曾有提出過(guò)溫度調(diào)控MscL通道開(kāi)放的設(shè)想，可惜并沒(méi)有進(jìn)一步的成果發(fā)表[34]。對(duì)于通道選擇性的調(diào)控，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些MscL突變修飾的方法可以改變通道口徑大小，以及調(diào)控特定電荷離子的滲透性。同時(shí)，利用MscL重構(gòu)于脂質(zhì)體上仍有活性的特點(diǎn)，已有研究表明將含有MscL的脂質(zhì)體裝在硅質(zhì)的微芯片裝置表面同樣可以保留正常生理活性，這是一種初步的在非生物材料上的分子開(kāi)關(guān)模型[35]。綜上所述，MscL通道是一種非常易于修飾設(shè)計(jì)的工具分子，其在生物納米技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用前景值得期待。