陳宗禮， 張樂元， 柏 勇， 楊 洋, 韓愛琴， 張枝嬋， 齊向英

( 陜西省紅棗重點實驗室 延安大學生命科學學院， 延安 716000)

染色體組型分析是植物遺傳育種和細胞學研究中非常重要的研究領(lǐng)域，近來在百合[1]、山核桃[2]、滿天星[3]、野生鐵線蓮屬[4]等植物中均有研究報道。棗屬植物的染色體在2013年前有研究報道[5-11]，但晉南1號棗樹及其花藥培養(yǎng)株系的染色體組分析未見報道。該棗樹是陜西省紅棗重點實驗室于1999年由楊凌農(nóng)博會引進的優(yōu)良鮮熟棗品種(現(xiàn)種植于延安大學生物園)，齊向英等2010年對該棗樹花藥開展了培養(yǎng)并于2012年獲得了再生試管苗，現(xiàn)存于陜西省紅棗重點實驗室(延安大學)，本研究對其進行了染色體組分析，旨在確定它的染色體組型及其特征，為其快繁與育種利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

晉南1號棗(Zizyphejujubemill Jinnan No. 1)花藥培養(yǎng)的再生株系第6代繼代培養(yǎng)試管苗。

1.1.2 主要儀器設(shè)備與藥品試劑

Olympus公司產(chǎn)Olympus BX41熒光顯微鏡和PM 10全自動顯微照相系統(tǒng)，Adobe公司產(chǎn)Adobe Photo-shop CS2分析軟件。

國產(chǎn)分析純藥品試劑：對二氯苯，KCl，加拿大樹膠，纖維素酶，果膠酶，改良苯酚品紅染液。

1.2 方法

1.2.1 預處理

隨機取其8瓶試管棗苗，在25℃～28℃、相對濕度為50%～70%的條件下暗培養(yǎng)7 d后，于早上10：00剪取其幼嫩葉片浸入飽和對二氯苯液在4℃處理4 h。

1.2.2 制染色體片

參照陳瑞陽等[12-13]的方法，采用改進的酶解去壁低滲-改良苯酚品紅染色法制片。主要過程為：將預處理過的嫩葉置于纖維素酶與果膠酶(各0.25%，pH 4)的混合液，在45℃恒溫離析5 h；再用0.075 mol/L KCl液于4℃低滲30 min，更換新液后再低滲40 min；將其濾干后浸入改良苯酚品紅染色液在4℃染24 h。脫水、透明、封片參照權(quán)燕敏等[10]的方法進行。

1.2.3 染色體組觀察與分析

將制好的染色體片經(jīng)自然風干后鏡檢，選處于分裂中期良好的分裂相計數(shù)并拍照。隨機選4張封片作為一次鏡檢重復，重復3次；用Microsoft Excel 對觀察結(jié)果進行統(tǒng)計分析；擇較好的圖像用Adobe Photoshop CS2軟件進行處理[14-15]并測量分析染色體的長度，計算其臂比指數(shù)、相對長度和核型不對稱系數(shù)等指標；按Levan[16]和李懋學等[17-18]的核型標準進行組型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體個數(shù)和組數(shù)

染色體分析結(jié)果見表1。從79個中期分裂相中檢測到的染色體數(shù)目有11條、12條、13條和14條4種類型；其中，12條的占84.81%(76.90%～92.72%)，而11、13和14條的分別占5.06%(0.23%～9.90%)。F檢驗表明，F(xiàn)數(shù)= 441.00>F0.01(6,3)= 9.78，各數(shù)目間差異極顯著，進一步經(jīng)SSR檢驗，具12條染色體的極顯著地高于具11、13和14條的，而11、13和14條相互間無統(tǒng)計差異。

李懋學和陳瑞陽認為，分析物種的染色體數(shù)時，在30個以上的統(tǒng)計細胞中有85%以上的具恒定一致的染色體數(shù)，便可確定是該植物的染色體數(shù)目[17]。借此說明，供試材料的染色體個數(shù)是不配對的12條，屬1個染色體組。

表1 晉南1號棗花藥培養(yǎng)再生株的染色體數(shù)目

注：※大寫字母不同者表示在0.01水平上染色體數(shù)目存在極顯著差異

表2 晉南1號棗花藥培養(yǎng)再生株染色體分析

注：染色體總長度 = 單細胞全部染色體長度之和；臂比指數(shù) = 長臂(g)/短臂(p)；相對長度(%)= (該染色體長度/總?cè)旧w長度)×100% ；相對長度系數(shù) = 該染色體長度/全組染色體平均長度；著絲粒指數(shù) = 短臂/該染色體全長×100； 核型不對稱系數(shù) (As．K%) = 全組染色體長臂總長/全組染色體總長。m:中著絲粒染色體；sm:近中部著絲粒染色體

2.2 染色體組型分析

供試材料12 條染色體的長度變化范圍在1.00～2.32 μm (表2)，全組染色體總長度為18.77 μm ，平均長度(1.56±0.40)μm；平均臂比指數(shù)1.47±0.40，變異范圍1.02～2.33；依據(jù)李懋學等[17-18]的染色體分類標準，其第1、2、4、5、6、8、9、10和第11這9條染色體的臂比指數(shù)在1～1.7(1.02～1.53)范圍內(nèi)，故均為中部著絲粒染色體；第3、7和第12這3 條染色體的臂比指數(shù)在1.7～3(1.79～2.33)范圍內(nèi)，故均為近中部著絲粒染色體；染色體組的核型不對稱系數(shù)為58.65%，說明其對稱程度較高，其組型按tebbins[19]的核型不對稱標準分析屬2B型；組型公式依Levan 等[17]和Kuo等[20]的染色體分類標準分析為n=1X=12=9m+3sm。組型圖及組型模式圖見圖1、圖2和圖3。

A: 壓片得到的染色體圖像；B; 將1A用Adobe Photoshop CS2軟件處理得到的圖像

圖1晉南1號棗樹花藥培養(yǎng)再生株細胞分裂中期染色體(n=12)

Figure 1 The metaphase chromosome of the cell division of the regenerated plant of the jujube anther culture in jinnan No.1(n=12)

圖2 晉南1號棗樹花藥培養(yǎng)再生株染色體組型圖

圖3 晉南1號棗樹花藥培養(yǎng)再生株染色體組模式圖

3 討論

3.1 棗樹染色體的大小與組型

栆屬植物的染色體研究集中在國內(nèi)，國外近期未見研究報道。國內(nèi)相關(guān)研究中，彭建營等指出，棗樹染色體屬小染色體(長1～4 μm)[6-10]；本研究顯示，晉南1號棗樹染色體長1.00～2.32 μm(表2)，因此也屬小染色體。齊向英等研究了狗頭棗、晉棗[7-8]，陳龍和彭建營研究了大荔龍棗、駿棗和冬棗[9]，權(quán)燕敏等研究了京棗[10]，指出這些棗樹品種的組型均為2B型；晉南1號棗樹的組型與上述棗樹的組型研究結(jié)果相一致，說明這些棗樹間的染色體組型是相對穩(wěn)定的，而在染色體長度間存在不同差異；這種長度間的差異是否是由不同品種棗樹間基因數(shù)量或基因的堿基數(shù)量差異，或是由于研究分析條件的不同所致，有待進一步研究。

Stebbins[19]認為，植物核型由對稱向不對稱發(fā)展是其進化的基本趨勢。系統(tǒng)演化較原始的植物核型相對較對稱，演化程度較高的植物其核型不對稱的程度也較高。本研究表明，晉南1號棗的核型不對稱系數(shù)為58.65%，與彭建營等[6]研究的河北省贊皇縣贊皇大棗的3個品系(分別為62.32%、63.83%和62.22%),齊向英等[7]研究的陜西延川狗頭棗(64.54%)，陳龍等[9]研究的陜西大荔龍棗(59.42%)、山西交城駿棗(58.37%)、河北滄州冬棗(60.58%)的都很接近。從現(xiàn)有資料來看，它們的核型不對稱系數(shù)均在58%以上，說明大棗屬于較進化類型。但是從比較它們的核型不對稱系數(shù)大小可以看出，它們的進化程度由低向高排序為駿棗—晉南1號棗—大荔龍棗—滄州冬棗—贊皇大棗—延川狗頭棗。這是由于在長期的栽培過程中人為干預選擇的結(jié)果。

3.2 染色體制片材料的解離

植物染色體制片中一般用酸解或酶解法解離材料。酸解法是在1 mol/L HCl中于 60℃恒溫下將材料解離幾至十幾分鐘[21]；該法簡單易學，應(yīng)用廣泛，但其所制壓片的染色體大部分仍包在解離不完全的胞壁中而難以觀察。酶解法是用果膠酶(1%～2%)與纖維素酶(1%～5%)的混合液在室溫下將材料解離2～5 h[21]，此法能較好地解離其胞壁和胞質(zhì)，所制壓片的染色體分散較好而便于觀察和計數(shù)。因此，本研究經(jīng)對比試驗選用酶解法制片。至于混合酶液中果膠酶和纖維素酶的配比濃度，則以不同研究中制片材料所含果膠、纖維素以及蠟質(zhì)的差異而不同。

3.3 染色體的組型分析

以往的組型分析，對染色體一般采用拍照、沖擴、剪切、排隊等多個操作程序來進行，遇到有重疊的染色體時則多擴洗照片再剪切；該法費時費力，尤其是遇到小而數(shù)量較多的植物染色體，易產(chǎn)生較大誤差而影響分析的正確性[15]。有一種全自動染色體分析系統(tǒng)被便利地用于組型分析中[22]，但其價格昂貴難以在一般實驗室應(yīng)用；目前，國內(nèi)多采用Photoshop軟件輔助進行組型分析，借此可調(diào)整原照片的亮度與對比度，除掉制片中的劃痕及斑點，并對重疊的染色體進行分離、修整等，使分析工作快捷而方便，準確性也得到提高[14-15,23-24]。因此本試驗采用Photoshop軟件輔助進行染色體組型分析。

4 結(jié)論

晉南1號棗樹花藥培養(yǎng)再生株系的染色體數(shù)目為12條，其平均長度為(1.56±0.40)μm，為小染色體；染色體組型屬2B型，其組型公式為n =1X =12 =9m+3sm，為單倍體?？山璐诉M一步開展快繁與單倍體育種等研究。