楊思鳴, 蔡東焱, 孫曼曼, 陳 霄, 戴曉峰, 白仲虎

(1. 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室， 無錫 214122；2. 江南大學 生物工程學院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室， 無錫 214122；3. 江南大學附屬醫(yī)院 腫瘤科， 無錫 214062)

犬瘟熱(Canine distemper, CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus, CDV)感染引起的急性、高度接觸性傳染病，是當前對我國養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)和野生動物保護業(yè)危害最大的疫病之一，造成了嚴重的經(jīng)濟損失[1]。近年來，陸續(xù)有不同種動物發(fā)生CD的報道，尤其是國寶大熊貓和獼猴等珍稀野生動物受犬瘟熱病毒感染致死事件的發(fā)生更是引起越來越多的學者對犬瘟熱病毒的關注和重視[2-3]。

犬瘟熱病毒感染細胞通過病毒囊膜上的H蛋白與被感染細胞表面特異性受體相結(jié)合，F(xiàn)蛋白介導膜融合使得病毒可以順利進入細胞進行復制。因此細胞是否表達能和H蛋白結(jié)合的特異性受體是影響細胞敏感性的關鍵因素[4]。目前已發(fā)現(xiàn)犬瘟熱病毒有3種受體，分別為CD46(Complement-regulatory protein 46，CD46)[5-6]和黏附連接蛋白(Nectin cell adhesion molecule 4, NECTIN4)[7]，其中NECTIN4分子IgV結(jié)構(gòu)可與犬瘟熱病毒H蛋白形成所有犬瘟熱病毒受體中最強的結(jié)合力[8-9]。

本研究通過克隆犬瘟熱病毒受體NECTIN4序列，在MDBK細胞中表達并通過G418篩選獲得了穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，成功利用牛源細胞培養(yǎng)犬源病毒，為稀有病毒的分離培養(yǎng)提供新的途徑，為工業(yè)疫苗生產(chǎn)細胞株的開發(fā)提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌株和細胞

載體pcDNA3.1(+)、克隆菌株DH5α由本實驗室保存。細胞系MDBK購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。犬瘟熱病毒購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)。

1.1.2 主要試劑

高保真聚合酶PrimerStar、T4 DNA連接酶(TaKaRa)，限制性內(nèi)切酶(Thermo)，膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(TIANGEN)。

DMEM(Hyclone)、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco)、鮭魚精(Sigma)、G418(Biosharp)、RNA提取試劑盒(TIANGEN)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR qRT-PCR試劑盒(TaKaRa)、蛋白裂解液RIPA、免疫熒光試劑盒(碧云天)、DAPI(BD)，抗Flag標簽的兔多抗、抗GAPDH兔多抗、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體、FITC標記的山羊抗兔IgG抗體(Proteintech)，F(xiàn)ITC標記的犬瘟熱病毒單克隆抗體(VMRD)。

這份按照里帕的引用頻次，由保羅·托奇的整理的，長達四頁的“所引用的作家目錄”索引表，可謂是一個有用的指引，后人從中大致可以得出《圖像學》對古代作品的依賴程度的判斷。

1.2 方法

1.2.1 犬NECTIN4表達載體的構(gòu)建

參考GenBank上登錄的犬源NECTIN4 mRNA序列(GenBank登錄號：NM_001313853.1)，在起始密碼子ATG 5′端添加酶切位點EcoR I和Kozak序列：GCCACC，編碼序列3′端添加Flag標簽、終止密碼子TGA和酶切位點XbaI，蛋白編碼序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后由上海捷瑞生物有限公司合成，酶切連接到載體pcDNA3.1(+)上，得到質(zhì)粒pcDNA-DogN4-Flag。

1.2.2 MDBK細胞轉(zhuǎn)染

胰酶消化細胞后使用預冷的PBS洗滌一遍，200 μL PBS重懸2×106個細胞，加入20 μg質(zhì)粒、10 μg鮭魚精后置于預冷的2 mm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴1 min，使用細胞電穿孔儀350 V、500 μs電擊3次，每次間隔1 min。最后使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基將細胞培養(yǎng)在6孔板中。

1.2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株篩選

轉(zhuǎn)染后48 h添加抗生素G418，使終濃度為1400 μg/mL，抗生素篩選一周后使用有限稀釋法挑取單克隆，命名為MDBK-N4細胞。

1.2.4 RT-PCR檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中NECTIN4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達

使用NCBI網(wǎng)站中Primer-blast功能設計逆轉(zhuǎn)錄PCR引物并交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。本試驗所用的引物見表1。

表1 本試驗所用的引物

MDBK細胞(陰性對照)和MDBK-N4細胞接種于6孔板，長至80%～90%匯合度時，利用試劑盒提取細胞的總RNA，取1 μg RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄PCR引物通過PCR擴增NECTIN4和GAPDH。PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像儀觀察并分析結(jié)果。

1.2.5 Western Blot檢測NECTIN4的表達

MDBK(陰性對照)和MDBK-N4細胞接種于6孔板，長至80%～90%匯合度時，使用裂解液RIPA裂解細胞，提取蛋白并定量。取30 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并利用電轉(zhuǎn)儀將目的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后TBST洗膜3次并使用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，封閉后TBST洗膜3次使用一抗4℃孵育過夜，一抗孵育后加入TBST洗膜3次使用二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗膜3次，BCL試劑顯色，使用化學發(fā)光凝膠成像儀觀察。

1.2.6 間接免疫熒光觀察NECTIN4和病毒外殼蛋白表達

NECTIN4樣品準備。MDBK(陰性對照)和MDBK-N4細胞接種于96孔板，長至50%～60%匯合度時可用于觀察NECTIN4的表達，進行間接免疫熒光實驗。

病毒外殼蛋白樣品準備。細胞長至70%～80%時，PBS洗滌1遍，接種50 μL犬瘟熱病毒，1 h病毒吸附完成后，換成2% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞出現(xiàn)明顯病變后，便可用于間接免疫熒光實驗。

間接免疫熒光。樣品制備完成后，使用PBS洗滌3次(后面洗滌操作亦同)，加入固定液室溫固定10 min，洗滌后通透液室溫通透10 min，洗滌后加入含2% 脫脂奶粉的PBS封閉1 h，洗滌后加入一抗室溫孵育1 h，再次洗滌后二抗孵育1 h，再次洗滌后DAPI染色10 min，洗滌后使用倒置熒光顯微鏡觀察蛋白的表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒pCDNA-DogN4-Flag的鑒定

限制性內(nèi)切酶EcoR I和XbaI的雙酶切結(jié)果顯示(圖1)，泳道1中5400 bp的條帶為被兩酶切開的pcDNA-DogN4-Flag質(zhì)粒骨架，1570 bp的條帶為兩酶切位點間所連接的NECTIN4片段。

M: DL10000 DNA marker; 1: pcDNA-DogN4-Flag (digested withEcoR I andXbaI)

圖1質(zhì)粒pcDNA-DogN4-Flag的鑒定

Figure 1 Identification of recombinant pcDNA-DogN4-Flag

2.2 MDBK-N4細胞株的鑒定

2.2.1 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測MDBK-N4細胞株中NECTIN4的表達

逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示(圖2)，以MDBK-N4細胞(第10代)的cDNA為模板進行PCR，泳道2、4顯示NECTIN4和GAPDH均有表達，以MDBK細胞的cDNA為模板，泳道1、3顯示只有GAPDH表達。說明MDBK-N4細胞中NECTIN4在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上有表達。

M: DL500 DNA marker; 1～2: MDBK cells and MDBK-N4 cells forNECTIN4; 3～4: MDBK cells and MDBK-N4 cells forGAPDH

圖2逆轉(zhuǎn)錄PCR分析MDBK-N4細胞系中NECTIN4 mRNA表達

Figure 2 The expression ofNECTIN4 mRNA detected in MDBK-N4 cells by using reverse transcriptional PCR

2.2.2 Western Blot檢測MDBK-N4細胞株中NECTIN4表達

Western Blot結(jié)果顯示(圖3)，相比對照組MDBK細胞，MDBK-N4細胞(第10代)在56 ku處有明顯條帶，說明MDBK-N4細胞能夠穩(wěn)定表達NECTIN4蛋白。

2.2.3 免疫熒光檢測MDBK-N4細胞株中NECTIN4的表達

免疫熒光結(jié)果顯示(圖4)，相比對照組MDBK細胞(圖4-A)，MDBK-N4細胞(第10代，圖4-B)中NECTIN4(綠光)有表達，且主要分布在細胞膜周圍，圍繞細胞核(藍光)，說明MDBK-N4細胞能夠穩(wěn)定表達NECTIN4，且蛋白轉(zhuǎn)運到細胞膜。

圖3 Western blot檢測MDBK-N4細胞NECTIN4蛋白的表達

A: MDBK cells; B: MDBK-N4 cells

圖4免疫熒光檢測MDBK-N4細胞中NECTIN4的表達(單細胞放大圖)

Figure 4 Expression of NECTIN4 detected in MDBK-N4 cells by fluorescent microscope (Enlarge for single cell)

2.3 免疫熒光檢測病毒感染后的MDBK-N4細胞

免疫熒光結(jié)果顯示(圖5)，受到犬瘟熱病毒感染3 d后，MDBK-N4細胞(第10代)產(chǎn)生了明顯病變現(xiàn)象，部分凋亡脫落，大部分細胞拉絲，病毒外殼蛋白(綠光)分布在細胞內(nèi)部，說明MDBK-N4細胞表達的NECTIN4發(fā)揮了病毒受體的功能，犬瘟熱病毒在細胞內(nèi)復制增殖產(chǎn)生了子代病毒，隨后感染周圍細胞，引起大量細胞凋亡。

A: MDBK cells; B: MDBK-N4 cells

圖5免疫熒光檢測細胞中犬瘟熱病毒的蛋白外殼(×20)

Figure 5 Envelope protein of canine distemper virus detected in MDBK-N4 cells by fluorescent microscope (×20)

3 討論

NECTIN4是一個黏附分子，既參與上皮組織的內(nèi)皮連接，也能夠作為單純皰疹病毒的受體，近年來，隨著對NECTIN4研究的深入，發(fā)現(xiàn)其也能作為麻疹病毒屬病毒的受體，例如充當犬瘟熱病毒的受體[7, 11]。此外，NECTIN4屬于免疫球蛋白超家族，與脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(Poliovirus receptor，PVR)同源，因此又被稱為PVRL4[12]。

關于表達外源受體的研究很多，以犬瘟熱的另一個受體SLAM蛋白為例，有報道在猴腎Vero細胞和犬細胞上表達SLAM蛋白能增強細胞對犬瘟熱病毒的分離能力[13]，但是此前已經(jīng)有關于Vero細胞能夠分離犬瘟熱病毒的報道了，表達受體僅僅增強了Vero細胞對野生新突變的犬瘟熱病毒株的分離能力[14]。此外，亦有學者在超越病毒宿主范圍的細胞株上進行表達受體建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的研究[15]，但是并未證明細胞對病毒的敏感性發(fā)生改變。本研究的創(chuàng)新之處在于證明表達受體可以拓展病毒的宿主范圍，令牛腎細胞接受犬瘟熱病毒的感染。筆者推測，由于病毒的侵染復制的方式多種多樣，需要與宿主細胞多個蛋白的相互作用。有些蛋白在物種間具有高度保守性，例如負責mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯和免疫相關功能等，但是能夠幫助病毒吸附和入侵的受體蛋白卻具有特異性，因此沒有一株病毒可以感染所有宿主。然而，受體蛋白也許是限制病毒侵染細胞的因素之一，絕非全部，否則關于此方面的研究應該有很多。表達了犬NECTIN4蛋白的MDBK-N4細胞株能夠發(fā)揮犬NECTIN4作為內(nèi)化受體的功能[11]，成功讓犬瘟熱病毒侵染到細胞內(nèi)并完成復制增殖的過程說明病毒進入細胞后MDBK細胞中再無明顯限制犬瘟熱病毒復制增殖的因素。這一試驗證明對于一些缺乏敏感細胞株的病毒，可以嘗試運用一些成熟的細胞系通過表達外源受體的方式完成病毒的分離培養(yǎng)和研究[16]。

在疫苗工業(yè)中，以犬瘟熱病毒疫苗舉例，傳統(tǒng)的疫苗使用雞胚繁殖得到的病毒制成，過程無法監(jiān)測，大規(guī)模培養(yǎng)困難，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定[17]。此后部分公司采用Vero貼壁細胞系作為培養(yǎng)犬瘟熱病毒的新宿主，受限于貼壁細胞系的性能，即使采用微載體培養(yǎng)，效率和成本也難以和懸浮培養(yǎng)相媲美。此外，微載體培養(yǎng)及其大型生物反應器制造的相關專利仍然掌握在國外幾個大公司手中，在國內(nèi)推廣的成本很高[18]。如果運用表達外源受體的方法，便可采用現(xiàn)有具備成熟培養(yǎng)工藝的懸浮細胞，例如CHO工程細胞株完成犬瘟熱病毒的培養(yǎng)，其產(chǎn)量、成本、過程的可控性將大大提升，工業(yè)前景廣闊[19]。此方法不僅可以用于犬瘟熱病毒疫苗的生產(chǎn)，亦可用于其他具備明確受體的病毒的培養(yǎng)，滿足疫苗工業(yè)在開發(fā)疫苗新品種時，對具備優(yōu)良性能細胞株的熱切需求[20]。