喬瑞娟， 程 睿， 李 威， 彭火英， 趙桂增， 張晨光

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.大慶油田總醫(yī)院檢驗科，黑龍江 大慶 163001)

肺結(jié)核病(pulmonary tuberculosis，PTB)是由結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的慢性肺部疾病，嚴重威脅人類健康[1]。全世界約有三分之一的人口感染了 MTB，但只有大約10%的感染者出現(xiàn)活動性結(jié)核病，而其余的則沒有癥狀[2]，由此表明個體遺傳因素與肺結(jié)核的易感性密切相關(guān)。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)存在于人類染色體上且分布廣泛，其可能影響啟動子活性和基因表達，從而與疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)許多基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性相關(guān)，如 CCL5、ASAP1、TLR10 基因內(nèi)的特定SNPs變異[3-5]。位于13號染色體的高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1 protein， HMGB1)是一種在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的普遍存在的核蛋白。HMGB1作為一種重要的晚期炎癥介質(zhì)，在腫瘤、免疫性疾病和感染性疾病的發(fā)病過程中起重要作用[6-8]。在抗結(jié)核感染過程中，MTB感染可以誘導單核及巨噬細胞分泌HMGB1，其濃度的高低可能反映結(jié)核病的嚴重程度[9]。由此推測HMGB1基因多態(tài)性可能與肺結(jié)核易感性有很大關(guān)聯(lián)。迄今為止還未發(fā)現(xiàn)關(guān)于HMGB1 SNPs與肺結(jié)核易感性之間的關(guān)聯(lián)研究。本研究是首次對豫北地區(qū)肺結(jié)核患者和健康人群HMGB1基因的3個SNPs進行病例對照研究，以探討HMGB1 SNPs與豫北地區(qū)肺結(jié)核患者易感性的相關(guān)性，為肺結(jié)核的診斷治療提供新的方向。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究選取2017年1—12月在新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院被確診為肺結(jié)核的320例患者作為結(jié)核組，診斷均符合我國肺結(jié)核的診斷標準(WS 196-2017)。排除標準為：(1)患心、肝、腎等疾病患者；(2)各類腫瘤及自身免疫性疾病患者；(3)慢性呼吸系統(tǒng)疾病如慢性支氣管炎、支氣管哮喘、支氣管擴張的患者；(4)慢性感染如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病等患者。對照組由該院同時期300名健康體檢者組成，均無慢性疾病及傳染病。本研究經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，事先獲得參與本次研究的每位患者和健康者的知情同意，自愿參與本項研究。

1.2 基因組DNA提取 結(jié)核組和對照組分別采集2～3 mL EDTA-K2抗凝全血，根據(jù)制造商的說明書，通過外周血基因組提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)從 EDTA-K2抗凝全血中分離出全血 DNA。提取的全血 DNA 保存于-20℃冰箱備用。

1.3 SNPs選擇及基因分型 選 擇 rs1412125(-1615A/G)、rs1045411(+1177G/A)、rs2249825(+3814C/G)三個位點，都是常見SNPs，這些SNPs的次要等位基因頻率均≥5%。rs1412125、rs1045411、rs2249825引物序列見表1。PCR擴增體系共26 μL，包括2×PFUMasterMix 12．5 μL(北京康為世紀生物科技有限公司)、去離子水10．5 μL、上下游引物各1 μL、DNA 1 μL。HMGB1 rs1412125擴增條件為：94℃ 5 min的初始變性，然后是94℃ 30 s，55．9℃ 30 s，72℃ 2 min，共循環(huán)35次，最后在72℃延伸5 min；HMGB1 rs1045411擴增條件為：94℃ 5 min的初始變性，然后是94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，共循環(huán)35次，最后在72℃延伸5 min；HMGB1 rs2249825擴增條件為：94℃ 5 min的初始變性，然后是94℃ 30 s，57．6℃30 s，72℃ 2 min，共循環(huán)35次，最后在72℃延伸5 min。所有的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定擴增目的產(chǎn)物的有無。擴增產(chǎn)物送公司進行測序，測序結(jié)果通過DNASTAR V7.0軟件記錄相應的SNPs位點。

表1 HMGB1 SNPs引物序列

2 結(jié)果

2.1 基本情況 320例結(jié)核組患者中男性123例(38．44%)，女性197例(61．56%)，平均年齡(37．91±11．01)歲。對照組300名健康體檢者中男性102例(34．00%)，女性198例(66．00%)，平均年齡(38．57±10．89)歲。所有的參與者均為漢族。兩組患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0．05)。見表2。

2.2 兩組間的3個 HMGB1 SNPs等位基因和基因型分布比較 兩組間3個位點的基因型頻率均符合 Hardy-Weinberg平衡(P>0．05)。rs1045411G/A位點 A 等位基因與肺結(jié)核的發(fā)病風險相關(guān)(OR=1．485，95%CI=1．110～1．986，P=0．007)，但兩組間rs1412125A/G 和rs2249825C/G 位點等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義(P>0．05)。見表3。在健康對照和肺結(jié)核患者中，rs1412125A/G、rs1045411G/A、rs2249825C/G位點的基因型分布最高頻率分別為純合AA、GG、CC，結(jié)核組和對照組的rs1045411G/A 基因型分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)，而rs1412125A/G、rs2249825C/G 基因型分布在兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0．05)，見表4。

表2結(jié)核組與對照組的基本特征[例(%)]

Table2Basic characteristics of tuberculosis group and control group(No. of cases[%])

基本特征結(jié)核組(n=320)對照組(n=300)χ2P性別 女197(61.56)198(66.00)1.3190.251 男123(38.44)102(34.00)吸煙史 有97(30.31)105(35.00)1.5490.213 無223(69.69)195(65.00)飲酒史 有77(24.06)84(28.00)1.2490.264 無243(75.94)216(72.00)

2.3 rs1045411G/A位點的遺傳模型與肺結(jié)核易感性之間的關(guān)聯(lián) rs1045411G/A 位點的共顯性模型中，與 GG 基因型相比，AG 基因型(OR=1．447，95%CI：1．025～2．041，P=0．035)和 AA 基因型(OR=2．812，95%CI：0．985～8．033，P=0．045)與肺結(jié)核的易感性相關(guān)；rs1045411G/A 位點的顯性模型[(AG+AA) vs GG]也與肺結(jié)核的易感性相關(guān)(OR=1．524，95%CI：1．090～2．131，P=0．014)；而在rs1045411G/A位點的隱性模型中[(AG+GG) vs AA]，以及在rs1045411G/A 位點的超顯性模型中[AG vs (GG+AA)]，病例組和對照組間差異無統(tǒng)計學意義(均P>0．05)，見表5。

表3 結(jié)核組和對照組的等位基因分布[例(%)]

注：兩組間三個位點等位基因分布均符合H-W平衡(P>0.05)

表4結(jié)核組和對照組的基因型分布[例(%)]

Table4Genotype distribution in tuberculosis group and control group(No. of cases[%])

SNPs基因型病例組(n=320)對照組(n=300)χ2Prs1412125 A/GAA191(59.69)190(63.33)0.9890.610AG110(34.37)92(30.67)GG19(5.94)18(6.00)rs1045411 G/AGG196(61.25)212(70.67)7.5870.023AG111(34.69)83(27.67)AA13(4.06)5(1.66)rs2249825 C/GCC222(69.37)227(75.67)3.0740.215CG91(28.44)68(22.67)GG7(2.19)5(1.66)

2.4 連鎖不平衡分析 rs1412125A/G與rs2249825C/G 之間 D′與r2分別為(0．24，0．30)；rs1412125A/G 與rs1045411G/A 之間 D′與r2分別為(0．53，0．22)；rs2249825C/G 與 rs1045411G/A之間 D′與r2分別為(0．37，0．10)。見圖1。

圖1 HMGB1 3個SNPs的連鎖不平衡分析

Figure1Analysis on linkage disequilibrium of three SNPs of HMGB1

表5 rs1045411G/A 位點不同遺傳模型與肺結(jié)核易感性的關(guān)聯(lián)[例(%)]

3 討論

肺結(jié)核是由 MTB引起的慢性肺部疾病，僅5%～10%的 MTB感染者會發(fā)展成具有臨床癥狀的疾病，多達90%的感染者為無癥狀感染[1-2]，因此，應重點關(guān)注宿主的個體易感性。近年來，肺結(jié)核易感基因位點的多態(tài)性已經(jīng)成為研究熱點，研究[10]證明遺傳因素與結(jié)核的感染和易感性密切相關(guān)。Mishra等[3]發(fā)現(xiàn) CCL5的-403G>A SNPs 與 PTB 易感性存在顯著關(guān)聯(lián)。Curtis等[4]發(fā)現(xiàn) ASAP1基因的SNPs與俄羅斯人群中 TB 的易感性相關(guān)。Li等[5]發(fā)現(xiàn)IFNG 基因rs2069718 TT 基因型與肺結(jié)核感染期間中的保護作用相關(guān)。因此，候選基因的選擇和其多態(tài)性位點的檢測一直被認為是 TB預防和治療的突破。

HMGB1是一種存在于真核細胞內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白。HMGB1在細胞內(nèi)外發(fā)揮多種作用，如免疫應答，DNA 修復，染色質(zhì)穩(wěn)定化，細胞凋亡和基因轉(zhuǎn)錄。HMGB1作為晚期炎癥介質(zhì)在腫瘤和各種炎癥性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-8]。與此同時，HMGB1在慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺癌、哮喘等慢性肺部疾病中有較高水平表達[10-13]，表明 HMGB1可能作為一種晚期促炎細胞因子參與肺部相關(guān)疾病的發(fā)病過程。肺結(jié)核患者體內(nèi)的許多固有免疫細胞，如巨噬細胞、單核細胞是產(chǎn)生HMGB1的主要細胞[14]。HMGB1在肺結(jié)核組織和血清中表達升高，表明 HMGB1可能參與抗結(jié)核反應，并且可以一定程度上反映組織的損傷程度[9]。但目前尚未發(fā)現(xiàn) HMGB1基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性有相關(guān)性的報道。因此，本研究是對 HMGB1基因多態(tài)性與豫北地區(qū)肺結(jié)核易感性的相關(guān)性首次探討。

在本研究中，通過對HMGB1 rs1412125(-1615A/G)、rs1045411(+1177G/A)、rs2249825(+3814C/G)三個位點SNPs基因分型來檢測HMGB1基因多態(tài)性與 PTB 易感性的關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，+1177G/A位點A等位基因可增加患肺結(jié)核的風險(OR=1．485，95%CI：1．110～1．986，P=0．007)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，+1177G/A 基因型分布在結(jié)核組和對照組間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0．023)，AG 基 因 型 (95%CI：1．025～2．041，P=0．035)發(fā)生肺結(jié)核風險是 GG 基因型的1．447倍，AA 基因型(95%CI：0．985～8．033，P=0．045)發(fā)生肺結(jié)核風險是 GG 基因型的2．812倍。這些數(shù)據(jù)表明rs1045411(+1177G/A)位點多態(tài)性與肺結(jié)核的易感性相關(guān)?；?’側(cè)翼區(qū)域的多態(tài)性可以控制基因表達，rs1045411(+1177G/A)多態(tài)性位于3’側(cè)翼區(qū)域，因此可能影響HMGB1基因的表達[8]，rs2249825(+3814C/G)多態(tài)性雖位于內(nèi)含子1中，但可能會影響v-Myb的結(jié)合位點，這被證明是HMGB1表達的強有力的增強子[15]，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)rs2249825多態(tài)性與肺結(jié)核的易感性相關(guān)，rs1412125(-1615A/G)位于 HMGB1上游-1615堿基對，它可能與人類切割的同源域結(jié)合，后者在抑制轉(zhuǎn)錄中起作用并起到轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用[16]；然而，該 SNPs也未發(fā)現(xiàn)與肺結(jié)核的易感性相關(guān)。為了找到最理想遺傳模型，本研究建立了rs1045411(+1177G/A)基因多態(tài)性的共顯性、顯性、隱性和超顯性模型。在rs1045411(+1177G/A)位點的顯性模型[(AG+AA) vs GG]也發(fā)現(xiàn)可以顯著增加患肺結(jié)核的風險(OR=1．524，95%CI：1．090～2．131，P=0．014)，而在rs1045411位點的隱性模型和超顯性模型中，結(jié)核組和對照組間差異無統(tǒng)計學意義。連鎖不平衡在人類基因組中表達，可以用作遺傳標記定位參與疾病檢測和治療的相鄰變體，然而本次研究的 HMGB1的3個位點未發(fā)現(xiàn)連鎖現(xiàn)象(r2<0．8)。

總之，本研究提示rs1045411(+1177G/A)位點多態(tài)性與肺結(jié)核的易感性顯著相關(guān)，同時為肺結(jié)核分子水平發(fā)病機制的確定提供基礎(chǔ)，這項研究可能會對肺結(jié)核的發(fā)展和治療提供新的思路。然而這項工作的局限性是缺乏患者的生存數(shù)據(jù)。因此，HMGB1多態(tài)性是否與肺結(jié)核患者的生存有關(guān)需要進一步檢查。此外，需要包含更多個體的更大型研究來檢查HMGB1多態(tài)性在肺結(jié)核進展中的功能。