鐘業(yè)騰，呂志輝，林 翀，林明冠，陳灼霖，蘇應(yīng)仙，陳少文，裴 華

(1. 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南 ?？?570311； 2. 海南省臨高縣疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，海南 臨高 571800)

結(jié)核病是當(dāng)前危害人類健康最重要的慢性傳染病之一[1]，是全世界公共衛(wèi)生面臨的重大威脅[2]。目前，全球結(jié)核病控制工作面臨著耐藥結(jié)核病疫情的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[3-4]，世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)約2/3的結(jié)核病患者處于耐多藥的危險(xiǎn)中[5]。實(shí)驗(yàn)室的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要是痰涂片、痰培養(yǎng)及藥敏，臨床上診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的培養(yǎng)[6]，而診斷耐多藥結(jié)核病的傳統(tǒng)方法是抗結(jié)核藥物敏感試驗(yàn)[7-8]。傳統(tǒng)檢測(cè)方法雖可靠，但費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，不能完全滿足臨床診療需求，還可能造成耐多藥菌株增多和傳播[9]。因此，建立早期、快速的耐藥性檢測(cè)技術(shù)是當(dāng)前控制結(jié)核病疫情的關(guān)鍵。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè) MTB的快速分子生物學(xué)方法主要有基因芯片法和線性探針法，兩種方法均是通過檢測(cè)標(biāo)本中 MTB 及其耐藥相關(guān)基因突變情況，判定是否感染 MTB 及其對(duì)利福平、異煙肼的耐藥情況，具有快速、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，一次能同時(shí)檢測(cè)十幾至幾十個(gè)基因位點(diǎn)，適用于多位點(diǎn)分析[10]。國(guó)內(nèi)很多地區(qū)開展了基因芯片法或線性探針法檢測(cè) MTB 及其耐藥基因，可能是出于經(jīng)濟(jì)成本的考慮，基本采用單個(gè)基因檢測(cè)方法，極少比較基因芯片法和線性探針法檢測(cè) MTB及其耐藥基因效果的相關(guān)報(bào)道[11]。在結(jié)核病防治工作中，患者痰是最直接的標(biāo)本來(lái)源，直接檢測(cè)痰中 MTB 及其耐藥基因，能更快地獲得 MTB 耐藥結(jié)果。本研究采用基因芯片法、線性探針法對(duì)海南地區(qū)疑似肺結(jié)核患者送檢的痰進(jìn)行檢測(cè)，并與改良羅氏培養(yǎng)法進(jìn)行比較；以比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，分析上述兩種方法檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥性的效能。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)制定的肺結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，凡符合下列之一均納入疑似肺結(jié)核患者：(1)有肺結(jié)核可疑癥狀的5歲以下兒童，同時(shí)具備肺結(jié)核患者密切接觸史、結(jié)核菌素試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性和γ-干擾素釋放試驗(yàn)陽(yáng)性中任一條；(2)僅胸部影像學(xué)檢查顯示與活動(dòng)性肺結(jié)核相符的病變。

按照以上診斷標(biāo)準(zhǔn)，將海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院2018年3—7月門診和住院的106例疑似肺結(jié)核患者納入研究范圍，其中男性 76 例，年齡 17～84歲，女性30例，年齡1～87歲。每例患者留取3份痰標(biāo)本，每份標(biāo)本2～3 mL，留取質(zhì)量較好的痰標(biāo)本2份，各取1 mL混勻，共獲得106份混合痰標(biāo)本，每份2 mL。每份標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行結(jié)核菌涂片、改良羅氏培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)、基因芯片及線性探針耐藥基因檢測(cè)，質(zhì)控菌株為 H37Rv ATCC 27294標(biāo)準(zhǔn)株，由國(guó)家疾病預(yù)防控制中心(CDC)結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 SlideWasherTM8芯片洗干儀、Bi-oMixerTMⅡ芯片雜交儀、ExtractorTM36核酸快速提取儀和 LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀等均為博奧生物集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，TwinCubator振動(dòng)平臺(tái)儀器為德國(guó) Hain Lifescience公司生產(chǎn)，TC-96/G/H(b)B基因擴(kuò)增儀和 Life Express基因擴(kuò)增儀均為杭州博日科技有限公司生產(chǎn)，BSC-1600ⅡB2型和 BSC-1600ⅡA2型生物安全柜均為蘇州安泰空

氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)，BPX-272電熱恒溫培養(yǎng)箱為上海博迅公司生產(chǎn)。

1.2.2 試劑 MTB DNA 提取試劑和晶芯結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒(DNA 微陣列芯片法)均為北京博奧生物集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，GenoType MTBDRplus試劑盒(PCR-線性雜交酶顯色法)為德國(guó)Hain Lifescience公司生產(chǎn)，分枝桿菌藥敏培養(yǎng)基(比例法)、改良酸性羅氏培養(yǎng)基(培養(yǎng)法)、結(jié)核菌抗酸染色液、對(duì)硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)鑒定培養(yǎng)基均為珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 痰標(biāo)本處理及痰涂片抗酸染色檢查 取患者痰標(biāo)本直接進(jìn)行痰涂片鏡檢，嚴(yán)格按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[12]的要求進(jìn)行痰涂片抗酸染色檢查，再加入等量的現(xiàn)配4%NaOH 溶液，渦旋振蕩混合后，室溫靜止15 min，制成預(yù)處理痰標(biāo)本。

1.4 改良羅氏培養(yǎng)法及菌種初步鑒定 用無(wú)菌吸管吸取已預(yù)處理的痰標(biāo)本上清液，各取0．1 mL(2滴)分別接種至改良羅氏培養(yǎng)基、PNB和 TCH 鑒定培養(yǎng)基上，盡量使菌液均勻鋪滿斜面，置37 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)第3天觀察結(jié)果后，每周各觀察1次，直到第8周。

1.5 比例法藥物敏感試驗(yàn) 用一次性無(wú)菌接種環(huán)刮取改良酸性羅氏培養(yǎng)基上(2～3周)的新鮮菌落，置于磨菌瓶中，研磨后與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)瞎鼙葘?duì)制成1 mg/mL菌懸液，用滅菌生理鹽水稀釋成10-2mg/mL和10-4mg/mL 2個(gè)濃度，然后用一次性無(wú)菌接種蘸取1環(huán)(即10 μL)，采用劃線法分別均勻接種至中性羅氏培養(yǎng)基和含利福平(40 mg/L)、異煙肼(0．2 mg/L)的藥敏培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)4周后觀察結(jié)果。

1.6 DNA提取 吸取1 mL已進(jìn)行預(yù)處理的痰標(biāo)本上清液于微量離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄去上清液；再加入1 mL的生理鹽水，充分振蕩后12 000 r/min離心5 min，棄去上清液；向微量離心管加入50 μL核酸提取液，混合均勻后，吸取所有混合液放入核酸提取管中，用核酸快速提取儀振蕩10 min，再置于95 ℃水浴10 min，12 000 r/min離心1 min，制備成核酸提取物。

1.7 PCR擴(kuò)增及雜交

1.7.1 基因芯片法 把 PCR 擴(kuò)增試劑1、2、3(分別含有 MTB鑒定基因擴(kuò)增引物、耐利福平rpoB基因擴(kuò)增引物、耐異煙肼katG/inhA 基因擴(kuò)增引物)按18 μL/管分裝于 PCR管中，將所得核酸提取物2 μL依次加入到PCR管中，混勻，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次，放入基因擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后按照說明書要求加入至 MTB耐藥檢測(cè)試劑盒的芯片點(diǎn)陣中，然后放入晶芯 Bi-oMixerTMⅡ雜交儀進(jìn)行芯片反應(yīng)，再將完成雜交的芯片放入晶芯SlideWasherTM8芯片洗干儀中進(jìn)行洗干，將洗干的芯片放入晶芯 LuxScanTM10K-B 微陣列芯片掃描儀中，利用晶芯結(jié)核分枝桿菌藥敏檢測(cè)分析系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)的讀取及結(jié)果判斷。

1.7.2 線性探針法 取核酸提取物5 μL加入用多重 PCR擴(kuò)增體系(含有 MTB 鑒定基因擴(kuò)增引物、耐利福平rpoB基因擴(kuò)增引物和耐異煙肼katG/inhA基因擴(kuò)增引物)中，放入基因擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物與GenoType MTBDplus試劑盒中的探針試紙按說明書進(jìn)行雜交，并判斷結(jié)果。

1.8 質(zhì)量控制 嚴(yán)格按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》的要求進(jìn)行質(zhì)量控制，痰標(biāo)本分枝桿菌分離培養(yǎng)的涂陽(yáng)培陰率應(yīng)小于10%，污染率應(yīng)小于5%；比例法藥物敏感性試驗(yàn)的高稀釋度菌液(10-4mg/mL)在中性羅氏培養(yǎng)基(對(duì)照培養(yǎng)基)上生長(zhǎng)的菌落數(shù)少于20個(gè)菌落，則應(yīng)從對(duì)照管傳代培養(yǎng)，重復(fù)試驗(yàn)。海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室每年均通過國(guó)家抗結(jié)核藥敏試驗(yàn)熟練度考核及結(jié)核病分子診斷技術(shù)能力驗(yàn)證。

1.9 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用 SPSS 20．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理，兩種方法的一致性檢驗(yàn)用Kappa檢驗(yàn)判別(Kappa≥0．75，兩者一致性較好；0．4≤Kappa<0．75，兩者一致性一般；Kappa<0．4，兩者一致性較差)，采用卡方檢驗(yàn)比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果，P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13]。

2 結(jié)果

2.1 痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)結(jié)果 對(duì)106份痰標(biāo)本進(jìn)行涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)，痰涂片抗酸染色陽(yáng)性率34．91%(37/106)，改良羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性率52．83%(56/106)，涂陽(yáng)培陰性率為8．11%(3/37)，未出現(xiàn)培養(yǎng)污染標(biāo)本，兩者均符合質(zhì)量控制的要求。56份培養(yǎng)陽(yáng)性痰標(biāo)本經(jīng)PNB及TCH 培養(yǎng)鑒定，46株為 MTB和10株為非結(jié)核分枝桿菌。

2.2 基因芯片法和線性探針法MTB檢出情況 106份痰標(biāo)本，基因芯片法檢出分枝桿菌52株，其中46株 MTB，6株非結(jié)核分枝桿菌；線性探針法檢出 MTB5 3株，基因芯片法、線性探針法 MTB的檢出率分別為43．40%、50．00%?；蛐酒ā⒕€性探針法與改良羅氏培養(yǎng)法檢測(cè) MTB 結(jié)果比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0．05)。見表1。

表1106份痰標(biāo)本基因芯片法和線性探針法 MTB檢出情況

Table1Detection of MTB from 106 sputum specimens by gene chip method and linear probe method

方法改良羅氏培養(yǎng)法(份)陽(yáng)性陰性χ2P基因芯片法陽(yáng)性40659.681.00陰性654線性探針法陽(yáng)性391436.910.19陰性746

注：以改良羅氏培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)

2.3 基因芯片法和線性探針法檢測(cè)MTB對(duì)利福平、異煙肼的耐藥性 以比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，鑒定為 MTB的46株菌株均進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)。同時(shí)采用基因芯片法和線性探針法檢測(cè)46株 MTB對(duì)利福平、異煙肼的耐藥性，兩種方法分別檢測(cè)出40、39株菌對(duì)兩種藥物的耐藥結(jié)果。

2.3.1 基因芯片法和線性探針法檢測(cè)MTB對(duì)利福平的耐藥性 基因芯片法、線性探針法與比例法檢測(cè) MTB對(duì)利福平的耐藥性比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0．05)，具有較好一致性(Kappa分別為0．85、0．78)。見表2。對(duì)利福平的耐藥性檢測(cè)，基因芯片法和線性探針法的靈敏度、特異度、符合率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值見表3。

表2基因芯片法和線性探針法檢測(cè) MTB對(duì)利福平的耐藥結(jié)果

Table2Rifampicin resistance of MTB detected by gene chip method and linear probe method

方法比例法(株)耐藥敏感PKappa基因芯片法耐藥2221.000.85敏感115線性探針法耐藥2230.630.78敏感113

表3 基因芯片法和線性探針法檢測(cè) MTB對(duì)利福平耐藥情況的診斷效能(%)

2.3.2 基因芯片法和線性探針法檢測(cè)MTB對(duì)異煙肼的耐藥性 基因芯片法、線性探針法與比例法檢測(cè) MTB對(duì)異煙肼的耐藥性結(jié)果比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0．05)，但一致性一般(Kappa分別為0．70、0．59)。見表 4。對(duì)異煙肼的耐藥性檢測(cè)，基因芯片法和線性探針法的靈敏度、特異度、符合率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值見表5。

表4基因芯片法和線性探針法檢測(cè) MTB對(duì)異煙肼的耐藥結(jié)果

Table4Isoniazid resistance of MTB detected by gene chip method and linear probe method

方法比例法(株)耐藥敏感PKappa基因芯片法耐藥1810.220.70敏感516線性探針法耐藥1730.730.59敏感514

表5 基因芯片法和線性探針法檢測(cè) MTB對(duì)異煙肼耐藥情況的診斷效能(%)

3 討論

臨床實(shí)驗(yàn)室通常會(huì)對(duì)疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行涂片抗酸染色和傳統(tǒng)培養(yǎng)，為臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)室的確診數(shù)據(jù)；但痰涂片抗酸染色陽(yáng)性率偏低，又無(wú)法鑒定是否為 MTB，也不能區(qū)分死菌與活菌，不足以滿足臨床需求[14-15]；傳統(tǒng)培養(yǎng)法雖可以分離鑒定 MTB并可進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，但是檢測(cè)時(shí)限過長(zhǎng)，也不能滿足臨床診療及患者的需要[16]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展并在結(jié)核病的診療領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，線性探針法和基因芯片法均很好地用于 MTB耐藥基因檢測(cè)，原來(lái)至少需4～8周的時(shí)長(zhǎng)，最快可縮短至1 d，節(jié)約臨床的診斷時(shí)間，也可防止MDR-TB的蔓延[17-18]。

基因芯片法與線性探針法雖檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)相差不大，但基因芯片法配有雜交儀、洗干儀及掃描儀等整套設(shè)備，自動(dòng)化程度較高；而線性探針法僅配有雜交儀，雜交、洗滌及結(jié)果判讀等實(shí)驗(yàn)步驟均需人工操作，人為影響因素較大，雜交時(shí)標(biāo)本及探針試紙也暴露于空氣中，容易造成交叉污染，但線性探針具有儀器設(shè)備投入成本低、試劑成本相對(duì)較低的優(yōu)勢(shì)。

本研究從檢出 MTB陽(yáng)性率的角度分析了改良羅氏培養(yǎng)法、線性探針法及基因芯片法的優(yōu)劣性。本研究中線性探針法 MTB檢出率為50．00%，低于郭明日等[19]報(bào)道的58%；基因芯片法 MTB檢出率為43．40%，高于吳國(guó)蘭等[20]報(bào)道的32．5%，兩種方法 MTB檢出率可能與患者所留痰標(biāo)本的質(zhì)量及保存條件有關(guān)。基因芯片法和改良羅氏培養(yǎng)法可直接鑒定出非結(jié)核分枝桿菌，而線性探針法不能鑒定出非結(jié)核分枝桿菌，因?yàn)榫€性探針法檢測(cè)耐藥基因試劑盒沒有相關(guān)檢測(cè)基因序列。線性探針法、基因芯片法對(duì) MTB 的檢出率與改良羅氏培養(yǎng)法比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明基因芯片法和線性探針法均可很好地應(yīng)用于痰標(biāo)本中 MTB的鑒定。

以比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，采用基因芯片法和線性探針法檢測(cè)痰標(biāo)本中 MTB利福平和異煙肼耐藥基因，基因芯片法對(duì)利福平和異煙肼的靈敏度為84．62%、69．23%，特異度為90．00%、95．00%，低于文獻(xiàn)[21-22]報(bào)道的結(jié)果，可能與地域差異或方法學(xué)的熟練度有關(guān)。線性探針法對(duì)利福平和異煙肼耐藥基因檢測(cè)的靈敏度為84．62%和65．38%，特異度均為85．00%，均低于文獻(xiàn)[23-24]報(bào)道(用線性探針法針對(duì)臨床分離株進(jìn)行檢測(cè))，本研究采用線性探針法直接檢測(cè)痰中 MTB耐藥基因。本研究采用線性探針法檢測(cè)痰標(biāo)本，效果不如直接對(duì)臨床分離株檢測(cè)耐藥基因好，但可節(jié)省2～4周的時(shí)間[25]，可有效快速指導(dǎo)臨床用藥。對(duì)海南地區(qū)疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行 MTB 的耐藥基因檢測(cè)，基因芯片法比線性探針法檢測(cè)效果相對(duì)好，可能是線性探針法在雜交過程與結(jié)果判讀均為人工，也可能是方法學(xué)或檢測(cè)的耐藥基因位點(diǎn)不同所致。

本研究檢測(cè)痰標(biāo)本 MTB 中利福平耐藥基因，分別將兩種耐藥基因檢測(cè)方法與比例法藥敏試驗(yàn)比較，結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有較高一致性，故兩種耐藥基因檢測(cè)方法在檢測(cè) MTB對(duì)利福平的耐藥性中有較好穩(wěn)定性。檢測(cè) MTB對(duì)異煙肼的耐藥性時(shí)，兩種方法與比例法藥敏試驗(yàn)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但一致性一般，結(jié)果與歐維正等[11]研究有所不同，可能與地域差異或方法學(xué)的熟練度有關(guān)。

本研究也存在一些局限性：(1)由于成本問題，本研究標(biāo)本數(shù)量相對(duì)不足，尤其是三種方法共同檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本相對(duì)較少，在耐藥性評(píng)價(jià)中存在局限性；(2)兩種耐藥基因檢測(cè)方法所檢測(cè)耐藥基因位點(diǎn)有所不同，故無(wú)法對(duì)其基因突變類型進(jìn)一步比較分析。研究首次采用兩種基因檢測(cè)方法直接檢測(cè)疑似肺結(jié)核痰標(biāo)本中 MTB及其相關(guān)耐藥基因，比較全面、客觀地評(píng)價(jià)這兩種基因檢測(cè)方法在本地區(qū)結(jié)核病診斷中應(yīng)用價(jià)值，為臨床實(shí)驗(yàn)室方法學(xué)選擇及臨床診療提供參考。

綜上所述，基因芯片法和線性探針法均可在海南地區(qū)疑似肺結(jié)核痰標(biāo)本中快速準(zhǔn)確鑒定MTB，也適用于結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平及異煙肼耐藥性快速檢測(cè)，值得臨床推廣。