胡云雙，周旺展，張穎，何衛(wèi)

（溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325000）

宮頸癌（cervical cancer，CC）作為婦科最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度非常高，目前在我國女性惡性腫瘤死因中居第8位[1]。研究表明，高危型HPV持續(xù)感染在CC及宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）的發(fā)生過程中起到關(guān)鍵作用，大多數(shù)婦女一生中曾感染過人類乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV），但細(xì)胞免疫可自發(fā)地清除HPV感染所引起的致癌性，只有少部分患者由癌前病變轉(zhuǎn)變?yōu)檫M(jìn)展期CC，這表明免疫調(diào)節(jié)在調(diào)控HPV致癌性中的作用[2]。輔助性T細(xì)胞（T-helper，Th）屬于T淋巴細(xì)胞亞群，在機(jī)體多種病理生理過程中起到關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)作用，近年來最新發(fā)現(xiàn)的Th22細(xì)胞可通過其分泌的細(xì)胞因子（IL-22和TNF-α）來促進(jìn)中性粒細(xì)胞的動員和活化，從而在銀屑病、Graves病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病和感染性疾病中起到重要調(diào)節(jié)作用[3-5]；Th17細(xì)胞通過釋放IL-17從而發(fā)揮促炎效應(yīng)，機(jī)體內(nèi)Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）比率升高可促進(jìn)CC的發(fā)生[6]。目前鮮有Th22細(xì)胞與CC相關(guān)性研究報(bào)道。本研究旨在通過分析Th22細(xì)胞在CC細(xì)胞中表達(dá)及其與Th17細(xì)胞在CC中的聯(lián)系，為CC的免疫治療提供有用的參考。

1 材料和方法

1.1 材料 收集溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科在2014年6月至2017年6月期間收治的41例CC患者，年齡47～71（62±7）歲。CC患者的臨床病理學(xué)特征見表1。收集35例CIN III期患者，年齡24～54（36±5）歲。選取同一時(shí)期的48例慢性宮頸炎（chronic cervi-citis，CCS）患者，年齡23～45（31±4）歲。所有患者均未接受放化療，其他排除標(biāo)準(zhǔn)包括糖尿病、高血壓、急慢性感染、充血性心力衰竭或其他惡性腫瘤，所有患者均經(jīng)過2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科專家確診。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者知情同意并簽署項(xiàng)目知情同意書。

表1 41例CC患者臨床病理特征

1.2 試劑與儀器 RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；抗CD4-PE-Cy5單抗、FITC標(biāo)記的IL-17單抗、FITC標(biāo)記的IL-22單抗和FITC標(biāo)記的IgG1單抗均購自美國BD公司；佛波酯、離子霉素和莫能霉素均購自美國Sigma公司；ELISA試劑盒購自奧地利Bender MedSystems公司。

1.3 Th22和Th17細(xì)胞的檢測 取200 μL肝素鈉抗凝全血，加入等量RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋后，再添加20 μL佛波酯（終濃度為25 ng/mL）、0.4 μL離子霉素（終濃度為1 μg/mL）和0.4 μL莫能霉素（終濃度為1.7 μg/mL），將上述液體充分混勻后放置在37 ℃和5% CO2條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h；孵育完成后，加入10 μL抗CD4-PE-Cy5單抗在室溫下避光反應(yīng)15 min；每個(gè)樣品中分別添加100 μL破膜/固定劑，室溫下避光反應(yīng)15 min；細(xì)胞經(jīng)洗滌后，再加入10 μL FITC標(biāo)記的IL-17單抗和IL-22單抗，同型對照為FITC標(biāo)記的IgG1單抗；細(xì)胞經(jīng)PBS清洗3遍后，再次添加300 μL PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果以CD4+IL17+IL22-細(xì)胞為Th17細(xì)胞，CD4+IL17-IL22+為Th22細(xì)胞。

1.4 IL-22、IL-17和TNF-α的檢測 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作步驟進(jìn)行，分別檢測各組樣本血清中IL-22、IL-17和TNF-α的表達(dá)水平，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處吸光度值（A450），實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，兩變量間相關(guān)性使用Pearson相關(guān)性分析，多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.13組患者外周血中Th17和Th22細(xì)胞表達(dá)水平比較 3組患者外周血中Th17和Th22細(xì)胞表達(dá)情況見圖1。Th17細(xì)胞和Th22細(xì)胞在CC組患者中的比率較CIN組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A。與CCS組比較，CIN組中Th17和Th22細(xì)胞的比率顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2B。CC組中Th17/Th22比值較CIN組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而CIN組中Th17/Th22與CCS組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2C。

2.2 Th22細(xì)胞和Th17細(xì)胞與CC患者臨床特征的相關(guān)性 Th22細(xì)胞和Th17細(xì)胞在41例CC患者外周血中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.527，P＜0.01），見圖3。但在CIN患者中未能觀察到兩者明顯相關(guān)性（P＞0.05）。Th22細(xì)胞在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的比率為（2.09%± 0.62%），顯著高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（1.33%± 0.27%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；但CC患者中Th22細(xì)胞的表達(dá)水平與患者分期、組織學(xué)類型、分化程度和腫瘤大小無明顯相關(guān)性，同時(shí)Th17細(xì)胞與CC患者臨床病理學(xué)特征均無相關(guān)性。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞和Th22細(xì)胞在CCS、CIN和CC組患者外周血中的表達(dá)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測3組患者外周血中Th22、Th17、Th17/Th22結(jié)果

圖341例CC患者外周血中Th22和Th17細(xì)胞的相關(guān)性分析

2.3 IL-22、IL-17和TNF-α在3組患者血清中的表達(dá) IL-22、IL-17和TNF-α在CC組患者中的表達(dá)量比CIN組和CCS組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與CCS組比，CIN組患者中IL-22、IL-17和TNF-α的表達(dá)量也顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

持續(xù)HPV感染是CC和CIN最主要的原因，而CC和CIN好發(fā)于免疫抑制的女性患者中，表明機(jī)體的免疫功能可有效抑制HPV的致癌性[7-8]。免疫細(xì)胞之間廣泛而動態(tài)的交聯(lián)以及細(xì)胞因子表達(dá)異常被認(rèn)為在CC的發(fā)生發(fā)展過程中起到舉足輕重的作用[9]。

表2 IL-22、IL-17和TNF-α在CCS、CIN和CC組患者血清中的表達(dá)差異（±s，pg/mL）

表2 IL-22、IL-17和TNF-α在CCS、CIN和CC組患者血清中的表達(dá)差異（±s，pg/mL）

與CCS組比：aP＜0.05；與CIN組比：bP＜0.05

組別 n IL-22 IL-17 TNF-α CCS組 48 45.85±12.52 43.27± 8.64 5.32±1.24 CIN組 35 78.94±20.67a 128.94±34.49a 8.47±2.08a CC組 41 112.34±34.41ab184.21±44.62ab12.54±4.52ab

既往研究表明，Th17和Th22細(xì)胞在機(jī)體病毒感染和黏膜免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮了一定作用[10]。本研究中Th17細(xì)胞被定義為CD4+IL17+IL22-細(xì)胞，而Th22細(xì)胞被定義為CD4+IL17-IL22+細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)對CC及CIN患者外周血中CD4+T細(xì)胞亞群進(jìn)行分析可知，Th17和Th22細(xì)胞在CC及CIN患者外周血中的表達(dá)量較正?；颊呔黠@升高，隨著宮頸病變的加重，Th17和Th22細(xì)胞的表達(dá)量升高更為明顯，表明在正常宮頸細(xì)胞發(fā)生癌前病變，再到CC發(fā)生的過程中，Th17和Th22細(xì)胞的表達(dá)量是逐漸升高的，從而推斷這兩種T細(xì)胞亞群在CC免疫反應(yīng)過程中起到了一定作用。

研究表明，IL-22作為一種主要由Th22細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在機(jī)體病毒感染所引起的炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮了一定作用，其主要效應(yīng)細(xì)胞是非造血細(xì)胞[11-12]。在本研究中，CC和CIN患者血清中IL-22的表達(dá)量明顯升高，進(jìn)一步表明IL-22的主要分泌細(xì)胞Th22細(xì)胞在CC發(fā)生發(fā)展中的作用。同時(shí)IL-17和TNF-α在CC和CIN患者血清中的表達(dá)也觀察到不同程度的上調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道[13]相仿。另外對Th17和Th22細(xì)胞在CC中的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析可知，Th17和Th22細(xì)胞在CC患者中的表達(dá)呈正相關(guān)，從而表明Th22細(xì)胞的分化可能與Th17細(xì)胞有關(guān)，或者Th22細(xì)胞有可能來源于Th17細(xì)胞。但在CIN及CCS患者中未能觀察到Th17和Th22細(xì)胞存在相關(guān)性，其可能原因是由于Th17和Th22細(xì)胞在這兩組患者體內(nèi)的含量較少，因此在真實(shí)情況和檢測結(jié)果之間的差異可能對統(tǒng)計(jì)學(xué)分析產(chǎn)生一定程度的偏倚。另一個(gè)可能原因是在異常環(huán)境中，Th17和Th22細(xì)胞來源和誘發(fā)因素存在較大差異，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，炎癥細(xì)胞表現(xiàn)出部分相互關(guān)聯(lián)的變異，從而導(dǎo)致IL22+Th17細(xì)胞表達(dá)上調(diào)。

對本次研究納入的41例CC患者臨床病理學(xué)特征進(jìn)行分析可知，CC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與Th22細(xì)胞的表達(dá)存在相關(guān)性，同時(shí)Th17和Th22細(xì)胞在CC患者中存在正相關(guān)，Th17和Th22細(xì)胞及其相關(guān)炎癥因子表達(dá)上調(diào)在CC發(fā)生發(fā)展過程中存在一定的協(xié)同作用，但Th17和Th22細(xì)胞之間具體的作用方式還需進(jìn)一步研究探討。

本次研究結(jié)果表明，Th17和Th22細(xì)胞在CC及CIN患者中表達(dá)上調(diào)，同時(shí)Th22細(xì)胞與CC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明這兩種T細(xì)胞亞型在CC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。