張瀘文 余婉松 夏蘇捷 陳 燕 王 柯

(1.上海市食品藥品檢驗所，上海 201203；2.賽默飛世爾科技〔中國〕有限公司，上海 201206)

五氯酚(pentachlorophenol，PCP)及其鈉鹽屬高毒有機氯農藥，在中國曾長期被用于消滅池塘、稻田內寄生血吸蟲的宿主釘螺以及養(yǎng)殖水體的消毒、清塘等[1]。五氯酚化學性質穩(wěn)定，自然界中降解緩慢，易通過水載體廣泛擴散，可通過食物鏈進入人體而蓄積，具有明顯的生物毒性以及致畸、致癌、致突變等毒副作用。世界各發(fā)達國家均將其列為優(yōu)先控制的持久性有機污染物之一，嚴格限制其使用[2-4]。中國農業(yè)部公告第193號及第235號和《無公害食品 漁用藥物使用準則》(NY 5071—2002)，均明確規(guī)定禁止五氯酚及其鈉鹽用于水生食品動物生產中。但近年來中國仍有部分漁民使用五氯酚鈉殺滅雜魚進行清塘，導致淡水沉積物中的五氯酚含量呈上升趨勢[5]，對漁業(yè)產品質量的影響仍較嚴重。因此，有必要建立準確、可靠、快速的檢測方法，從源頭上對水產品生產養(yǎng)殖和流通環(huán)節(jié)進行安全監(jiān)控。

目前五氯酚常用的檢測方法有氣相色譜法(GC)[6]、液相色譜法(LC)[7]、氣相色譜—質譜法(GC-MS)[8]、液相色譜—串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)[9]和超高效液相色譜—高分辨質譜法(UPLC-HRMS)[10]。盡管此類方法具有較高的靈敏度和準確度，但是試驗耗時較長，試驗儀器規(guī)模較大，對操作人員要求高，并不適合現(xiàn)場快速檢測。

表面增強拉曼光譜(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)技術是基于當激光照射到金、銀等金屬粗糙表面或溶膠中，由于電磁交互作用使得金屬表面電場增強，將吸附在金屬粗糙表面的待測物拉曼散射信號強度增加104～106倍的類共振增強效應而研發(fā)出來的一種新型光譜分析檢測技術[11]。表面增強拉曼光譜具有百萬級的光譜增強能力，且具備無需樣品前處理、靈敏度高、操作簡單、檢測速度快、易實現(xiàn)現(xiàn)場檢測等優(yōu)點[12]，在食品安全快速監(jiān)測領域獲得了廣泛的應用[13-15]，在水產品及加工制品中有毒有害物質快速檢測方面越來越受到重視。王利華等[16]應用SERS技術實現(xiàn)了對水產類產品中孔雀石綠的快速高靈敏檢測，實際可測最低濃度為0.5 μg/L。郭小瑩等[17]以銀溶膠為活性基底，應用SERS技術實現(xiàn)對水產魚制品中組胺的快速定量檢測，最低檢測濃度為10 mg/L，遠低于GB 5009.208—2016中水產品中組胺最大限量檢測限50 mg/L。

結合便攜式拉曼光譜儀，試驗擬采用表面增強拉曼光譜技術建立養(yǎng)殖水中五氯酚及其鈉鹽的殘留量檢測方法，以期為生產、流通環(huán)節(jié)中五氯酚及其鈉鹽殘留的現(xiàn)場、快速檢測探索新的途徑和方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

五氯酚鈉標準品(CAS號131-52-2)：純度>99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

硝酸銀、檸檬酸三鈉：純度>99.0%，美國Sigma公司；

氯金酸：純度99.99%，百靈威科技有限公司；

甲醇：色譜純，德國Merck公司；

氯化鈉、氯化鉀、碘化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、三氯化鐵、硫酸鎂、硫酸鉀、氫氧化鉀、硝酸和氯化鎂：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

0.45 μm水相濾膜：天津津滕公司；

實驗室用水為Milli-Q超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.1.2 儀器設備

便攜式拉曼光譜儀：FoodDefender RM型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

高速離心機：CR21G型，德國Eppendorf公司；

渦旋儀：VORTEX 4 digital型，德國IKA公司；

天平：Sartorius BS 2202S/CP225D型，德國Sartorius公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試劑的制備

(1)金溶膠的制備：準確量取0.01%的氯金酸溶液100 mL于圓底燒瓶中，1 100 r/min磁力攪拌條件下加熱至沸騰，迅速加入1%的檸檬酸三鈉水溶液1 mL，繼續(xù)加熱至顏色呈酒紅色后持續(xù)加熱15 min，冷卻至室溫后調pH≈7，于冰箱內4 ℃避光保存[18-19]。

(2)銀溶膠的制備：精密稱量45 mg硝酸銀于圓底燒瓶中，加入250 mL超純水溶解，安裝好冷凝回流裝置，加熱至沸，逐滴加入5 mL質量濃度為1%的檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱1 h后停止。冷卻至室溫后于冰箱內4 ℃避光保存[20]。

(3)濃縮金溶膠的制備：準確量取制備的金溶膠2 mL 于離心管中，10 000 r/min離心10 min，移除透明水層，重復操作至下層剩余0.1 mL，渦旋混勻即得濃縮金溶膠[21]。

1.2.2 空白試樣的選擇 選取水產品養(yǎng)殖用水作為空白試樣，均購自上海本地菜場，按GB 23200.92—2016《食品安全國家標準 動物源性食品中五氯酚殘留量的測定 液相色譜—質譜法》進行檢測，經檢測不含五氯酚。

1.2.3 標準溶液配制

(1)標準儲備溶液(100 μg/mL)：精密稱取五氯酚鈉標準品10 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為100 μg/mL標準儲備溶液。此儲備液可在-18 ℃以下避光存放12個月。

(2)標準工作溶液(1 μg/mL)：精密量取五氯酚標準儲備溶液100 μL，置10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為1 μg/mL標準工作溶液。

1.2.4 樣品檢測方法 取養(yǎng)殖水適量，用0.45 μm水相濾膜過濾，待測。取100 μL濃縮金溶膠，依次加入0.01%硝酸溶液20 μL，水樣100 μL，0.2 mol/L硫酸鎂溶液20 μL，0.2 mol/L碳酸鈉溶液20 μL，充分混勻，1 min后檢測分析。

1.2.5 拉曼光譜測定 激發(fā)光源波長785 nm，激光光源功率250 mW，光譜采集范圍250～2 875 cm-1。每個樣品平行測定3次，并將采集的光譜計算平均值用于數(shù)據分析。

1.3 數(shù)據處理

圖表處理主要采用Origin 8.0與Microsoft Excel軟件。

2 結果與分析

2.1 五氯酚特征峰歸屬

五氯酚的SERS譜圖如圖1所示。五氯酚的主要組成部分苯環(huán)、C—Cl、C—O的拉曼頻率主要集中在300～1 600 cm-1，其主要特征峰在圖譜中清晰可見，具體歸屬：341 cm-1處C—O彎曲振動和苯環(huán)變形振動；381 cm-1處面外環(huán)彎曲振動；486 cm-1處的C—O伸縮振動；762 cm-1處的苯環(huán)變形振動和C—Cl伸縮振動，1 118，1 277 cm-1處的苯環(huán)伸縮振動和C—H彎曲振動。上述譜峰均可作為定性鑒別五氯酚的特征譜峰。

2.2 拉曼檢測條件的優(yōu)化

2.2.1 納米增強試劑的選擇 試驗比較了金溶膠、濃縮金溶膠及銀溶膠對五氯酚的增強效果，圖譜見圖2。結果表明，銀溶膠的催化活性較弱，不足以產生拉曼增強效果。金溶膠的拉曼增強效果不佳，SERS信號較弱。而使用濃縮金溶膠作為增強基底時，能得到很好的SERS圖譜，五氯酚各個特征峰拉曼信號較強。因此，考慮增強效果與峰形規(guī)則性等因素，濃縮金納米溶膠是五氯酚較為理想的納米增強試劑。

圖1 五氯酚的SERS光譜圖

2.2.2 納米溶膠體積 SERS技術的原理是待測分子與納米基底表面產生一定的吸附作用，整個體系的極化率發(fā)生變化從而放大分子的拉曼信號，故待測物質與納米基底之間的有效吸附直接影響到拉曼增強效應。分別選擇加入量為20，50，100，200 μL的增強基底濃縮金溶膠，對10 μg/mL五氯酚標準溶液進行拉曼光譜圖檢測。如圖3所示，逐漸增加納米粒子體積后，特征峰的強度呈現(xiàn)先增后減的趨勢。納米粒子的用量增加使得物質與納米粒子結合更充分，拉曼響應信號有一定程度的增強，但當納米粒子用量增加到一定程度后，SERS信號反而減少，可能是由于金溶膠導致五氯酚表面形成過厚的包裹層，導致五氯酚中的電子躍遷概率降低，導致信號減弱。當納米溶膠體積為100 μL，增強效果最明顯，因此選取濃縮金溶膠的最佳體積為100 μL。

圖2 五氯酚納米增強試劑優(yōu)化拉曼光譜圖

圖3 不同體積納米溶膠對五氯酚拉曼光譜強度的影響

Figure 3 The intensity of Raman spectra of pentachlorophenol with various volumes of colloidal nanoparticles solution

2.2.3 促凝劑的優(yōu)化 添加適量的無機鹽作為促凝劑可以改變溶膠中納米顆粒的分散狀態(tài)，形成聚集體，進而產生更多的SERS熱點，增強樣品的拉曼信號強度。試驗分別考察濃度均為0.1 mol/L的氯化鈉、氯化鉀、碘化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、三氯化鐵、硫酸鎂、硫酸鉀和氯化鎂試劑作為促凝劑，檢測濃度為10 μg/mL的五氯酚標準溶液的SERS光譜圖。檢測時溶液中促凝劑的添加體積均為20 μL，在促凝劑加入1 min后采集SERS光譜以保證溶膠的促凝達到穩(wěn)定狀態(tài)。單個促凝劑優(yōu)化的五氯酚拉曼光譜圖如圖4(a)所示，以MgSO4作為溶膠促凝劑，拉曼光譜可觀測到非常明顯的拉曼特征峰，具有更好的SERS增強效果。同時，通過比較單一促凝劑和多種促凝劑組合的SERS增強效果，以MgSO4和Na2CO3組合作為促凝劑，比單一其中一種促凝劑的增強效果均好，結果如圖4(b)所示。因此選擇MgSO4和Na2CO3作為后續(xù)SERS分析中的促凝劑。

2.2.4 促凝劑用量的優(yōu)化 適量的促凝劑能使納米顆粒產生更多熱點從而增強SERS信號，但當促凝劑過量時納米顆粒會發(fā)生過度團聚，大大影響SERS效果。試驗對MgSO4和Na2CO3的用量對五氯酚SERS信號的影響進行對比研究，結果表明促凝劑MgSO4和Na2CO3濃度均為0.2 mol/L，體積為20 μL時，五氯酚SERS增強效果最優(yōu)。

2.2.5 試劑加入順序的優(yōu)化 五氯酚與促凝劑的加入順序對SERS信號有較大的影響。若先加入促凝劑后再加入待測樣品，會導致金納米粒子發(fā)生團聚，SERS效果較差；而先將增強基底和分析物混合之后再加入MgSO4和Na2CO3，SERS效果較好。因此，試劑的加入順序為金納米粒子、分析物、MgSO4和Na2CO3。

圖4 單個促凝劑和兩種促凝劑組合對五氯酚測定的影響

Figure 4 Effects of different single coagulant and the combination of two coagulants on Raman spectra of pentachlorophenol

圖5 pH值對SERS強度的影響

2.2.7 吸附等待時間 設定五氯酚與增強基底濃縮金溶膠的吸附等待時間從30 s至12 min，結果如圖6所示。吸附等待時間從30 s至12 min，五氯酚的SERS信號無明顯差異，說明濃縮金溶膠與五氯酚標準液混合反應迅速，所產生的活性熱點相對穩(wěn)定，二者混合液有很好的化學穩(wěn)定性。12 min內的反應時間對測定基本無影響，均可測定。

圖6 納米溶膠在放置不同時間后對五氯酚增強效果對比圖

Figure 6 Comparison of SERS spectra of pentachlorophenol in colloidal nanoparticles in different mixing time

2.3 方法學考察

2.3.1 定性分析

(1)檢出限：取空白養(yǎng)殖用水若干份，分別添加濃度為0.0，0.1，0.2，0.5 μg/mL五氯酚標準品至空白樣本中，按照分析步驟進行測定，每個濃度測定6次，觀察檢測結果，當五氯酚為0.5 μg/mL時，拉曼檢測結果均為陽性，最終確定五氯酚的檢出限為0.5 μg/mL。

(2)假陰性率和假陽性率：取空白養(yǎng)殖水若干，分別添加五氯酚標準溶液，分別制成添加水平為0、最低檢出限、2倍最低檢出限的樣品各一式20份，按五氯酚前處理方法和分析步驟進行結果測定。檢測結果顯示，五氯酚中20份空白樣本的檢測結果為陰性的20個，陽性的0個，假陽性率為0%；五氯酚中40份陽性添加濃度樣本的檢測結果為陽性的39個，陰性的1個，假陰性率為2.5%。

(3)特異性：五氯酚的特異性為100%，符合食藥監(jiān)科便函[2017]43號《食品快速檢測方法評價技術規(guī)范》要求。

(4)與現(xiàn)有方法一致性分析：將試驗方法與基準方法GB 23200.92—2016 《食品安全國家標準 動物源性食品中五氯酚殘留量的測定 液相色譜—質譜法》檢測所得到的陽性結果比率相比較，這兩種方法在5%置信區(qū)間內不存在統(tǒng)計學差異(2<3.84)；同時方法的靈敏度、特異性>95%、假陰性率和假陽性率<5%，均符合食藥監(jiān)科便函[2017]43號《食品快速檢測方法評價技術規(guī)范》的要求。

2.3.2 定量分析

(1)標準曲線：選取486 cm-1處的特征峰作為分析對象，取質量濃度分別為0.2，0.5，1.0，2.0，4.0 μg/mL的系列標準溶液，在已優(yōu)化的條件下，以486 cm-1處峰強度對相應的質量濃度作圖，繪制標準曲線，并計算五氯酚線性回歸方程及其相關系數(shù)，結果見圖7。在0.2～4.0 μg/mL濃度范圍內，五氯酚線性方程為y=0.025 2x+0.010 3，線性關系良好，相關系數(shù)r為0.992 8。

圖7 不同濃度五氯酚標準溶液SERS譜圖及標準工作曲線

Figure 7 SERS spectra of pentachlorophenol in colloidal nanoparticles with different concentrations and the relationship between the Raman intensity and pentachlorophenol concentration

(2)回收率及精密度試驗：以魚和蝦養(yǎng)殖水為代表基質，進行添加回收和精密度試驗。選取空白樣品，添加五氯酚標準品，分別制成添加水平為0.5，1.0，2.0 μg/mL的樣品各6份，進行加標回收率試驗，計算平均回收率和相對標準偏差，考察方法的準確度和精密度。由表1可見，各添加水平的平均回收率為78.74%～112.30%，精密度為6.1%～11.3%，方法的準確度與精密度均滿足殘留分析的要求。

2.4 實際樣品測定

為驗證方法可行性，收集各品種水產品養(yǎng)殖水，包括蝦類、魚類、貝類等樣品基質養(yǎng)殖用水共60批樣品，分別按照SERS拉曼法與確證方法GB 23200.92—2016《食品安全國家標準 動物源性食品中五氯酚殘留量的測定 液相色譜—質譜法》進行檢測，測定結果一致。

表1 加標樣品的回收率及其RSD

3 結論

基于SERS技術建立了養(yǎng)殖水樣中五氯酚的快速檢測方法。選取濃縮金溶膠為活性基底，通過優(yōu)化增強基底的加入量、pH、促凝劑的選擇和加入順序等拉曼增強條件，以獲得最佳的SERS信號。最佳試驗條件下，定性方法靈敏度和特異性≥95%，假陰性率和假陽性率≤5%，結果均符合食品快速檢測方法評價技術規(guī)范。該方法不需復雜的前處理，靈敏度和準確度高，單個樣品檢測時間在5 min內，所得結果令人滿意，較好地滿足了現(xiàn)場快速檢測的需求。該方法目前主要用于養(yǎng)殖水中五氯酚殘留的快速檢測，后續(xù)可進行不同動物源樣品中五氯酚殘留量SERS檢測的探索。