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(長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,湖南長沙 410114)

蔬菜在生長過程中會從土壤及氮肥中獲得硝酸鹽類物質(zhì),在蔬菜進一步加工處理過程中,硝酸鹽類物質(zhì)會被還原成亞硝酸鹽,同時,亞硝酸鹽由于具有發(fā)色、抑菌抗氧化作用被作為食品添加劑廣泛用在食品領(lǐng)域[1]。但亞硝酸鹽與血紅蛋白結(jié)合,使紅血球運輸氧的能力減弱,對人體造成危害。在酸性條件下,亞硝酸鹽可以與蛋白質(zhì)中的胺類結(jié)合生成強致癌物質(zhì)亞硝酰胺,嚴(yán)重威脅人類生命健康[2]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定醬腌菜中亞硝酸鹽含量不得超過20 mg/kg[3]。亞硝酸鹽是國家和地方標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的在食品行業(yè)中要嚴(yán)格控制殘留量的化學(xué)物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

榨菜 購自商場,12個品牌5～7個批次共60個不同樣品;亞鐵氰化鉀溶液 廣東光華科技股份有限公司,106 g/L;乙酸鋅溶液 上海展云化工有限公司,220 g/L;飽和硼砂溶液 廣東光華科技股份有限公司,50 g/L;對氨基苯磺酸溶液 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司,4 g/L;鹽酸萘乙二胺溶液 天津市致遠化學(xué)試劑有限公司,2 g/L;亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 廣東光華科技股份有限公司,200 μg/mL;亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液 廣東光華科技股份有限公司,50 μg/mL;鹽酸 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司,0.42 mol/L；所用試劑均為分析純。

GL323-1SCN型分析天平 賽多利斯公司 HH-M2型恒溫水浴鍋 上海赫田科學(xué)儀器有限公司 FK-A型組織搗碎機 國盛公司 TY-727型分光光度計 金義博儀器科技有限公司 Antaris Ⅱ型傅立葉近紅外光譜分析儀 Thermo Nicolet公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品化學(xué)值測定 依照國家標(biāo)準(zhǔn)文獻GB500933-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[11]中的第二種方法分光光度法,市售榨菜樣品經(jīng)粉碎研磨后過篩(50目),將經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)的樣品溶液于538 nm波長處測量對應(yīng)的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,最后確定樣品中亞硝酸鈉殘留量[9]。

計算公式:

式中:m1-樣品中亞硝酸鈉質(zhì)量(μg)；1000-轉(zhuǎn)換系數(shù)；m2-試樣質(zhì)量(g)；v1-測定用樣液體積(mL)；v0-試樣處理液總體積(mL)。

1.2.2 樣品光譜采集 將60 g榨菜樣品放入攪拌機中攪碎,加入200 mL去離子水混合均勻后過濾,所得濾液加入亞硝酸鈉,制成亞硝酸鈉含量為0.122～39.0875 mg/kg,濃度梯度為0.66 mg/kg的60個樣本,將樣本裝入液體透射試劑管中,待傅立葉變換近紅外光譜儀預(yù)熱1 h后,采用液體透射采集工作流,智能投射附件樣品類型采集近紅外光譜,掃描波數(shù)范圍:開始4000 cm-1;結(jié)束10000 cm-1,經(jīng)液體透射&平均譜工作流優(yōu)化:分辨率8.0 cm-1,每張光譜累積掃描次數(shù)64次,增益為4×,每個樣品掃描3次,取平均光譜作為樣品光譜,環(huán)境溫度25 ℃,濕度46%,內(nèi)置背景為參考。

1.2.3 光譜數(shù)據(jù)處理 采用Antaris Ⅱ型傅立葉近紅外光譜分析儀以及TQ Analyst軟件,將采用國標(biāo)法測得的實際數(shù)值與采集到的近紅外樣品光譜相關(guān)聯(lián),對比偏最小二乘法(PLS)和主成分分析(PCR)兩種光譜處理分析方法,利用馬氏距離法除去相近和異常樣品數(shù)據(jù),從而建立最佳數(shù)據(jù)光譜模型[12]。

1.2.4 模型預(yù)測能力評估 模型相關(guān)系數(shù)(r)、內(nèi)部交叉驗證均方根誤差(RMSECV)和外部預(yù)測均方根誤差(RMSEP)的數(shù)值大小可以反應(yīng)TQ analyst 9軟件所建立光譜模型的預(yù)測性能。其中模型相關(guān)系數(shù)(r)越接近1,RMSECV,RMSEP越小,模型的預(yù)測性能越好[13]。計算方法如(3)～(5)所示[10]:

式(1)

式(2)

式(3)

式(4)

式(5)

其中,本實驗取樣品總數(shù)70個,校正集60個,驗證集10個。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用TQ analyst軟件進行模型建立,選取最佳模型得出模型預(yù)測值,與實際測量值利用EXCEL(Microsoft)進行F檢驗與等方差t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 國標(biāo)法檢測樣品中亞硝酸鈉

由1.2.1方法測得樣品吸光值為0.122,代入圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線公式:y=0.2178x+0.0539得到x=0.3127 μg,由公式:

圖1 國標(biāo)法測量亞硝酸鈉含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of sodium nitrite measured by national standard method

2.2 榨菜樣品近紅外原始透射光譜常規(guī)分析及建模波段選擇

圖2 亞硝酸鈉濃度對水近紅外光譜的影響Fig.2 Effects of sodium nitrite concentration on water near-infrared spectroscopy

圖3 榨菜樣品近紅外原始透射光譜圖Fig.3 Raw near infrared transmission spectra of the sample of pickled mustard

圖4 榨菜種亞硝酸鈉經(jīng)一階微分和平滑預(yù)處理的近紅外光譜透射曲線Fig.4 Near-infrared spectral transmission curves of sodium nitrite by first-order differential and smooth pretreatment

圖5 榨菜樣品中亞硝酸鹽近紅外平均光譜Fig.5 Near infrared mean spectrum of nitrite in the sample of pickled mustard

2.3 最佳主因子數(shù)

主成分因子數(shù)影響模型的預(yù)測能力。交叉驗證方根誤差(RMSECV)會隨主成分因子數(shù)改變而改變,由圖6可知,RMSECV先隨著主成分?jǐn)?shù)的增大而減小,當(dāng)主成分因子數(shù)為6時對應(yīng)的RMSECV最小,隨后隨著主成分?jǐn)?shù)的增大而增大。RMSECV最小值所對應(yīng)的主成分因子數(shù)即為光譜模型的最佳主因子數(shù)[19]。若選取的主成分?jǐn)?shù)過少,即模型的主因子數(shù)過小,會丟失原始光譜中較多有用信息,擬合不充分;若選取的主成分?jǐn)?shù)過多,即模型的主因子數(shù)過大,則會出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象[20];當(dāng)主因子數(shù)大于8時,會大大增加過擬合現(xiàn)象的可能性,本實驗采取的交互驗證方法選取的最佳主成分因子數(shù)為6,此時模型效果最佳。

圖6 基于全光譜的PLS模型最佳主成分?jǐn)?shù)Fig.6 Optimal main fraction of PLS model based on full spectrum

2.4 光譜處理比較

如圖7～圖11分別顯示出利用偏最小二乘法(PLS)比較無預(yù)處理、一階微分處理(1D)、二階微分處理(2D)與Savitzky-Golay filter 濾波平滑互相組合后的光譜建模效果,經(jīng)TQ analyst 9軟件計算,結(jié)果顯示一階微分(1D)與Savitzky-Golay filter 濾波平滑組合對光譜進行預(yù)處理后的主成分?jǐn)?shù)為6,是上述最佳主成分?jǐn)?shù),且內(nèi)部交叉驗正均方差(RSMEC)、外部預(yù)測均方根誤差(RMSEP)值分別為0.0310、0.0141最接近于0,Rc、RP值分別為0.9720,0.9925接近于1,建模效果最優(yōu),其中無預(yù)處理的PCR亞硝酸鈉模型Rc、RP值分別為0.9833,0.9937雖然相比較于經(jīng)一階微分(1D)、Savitzky-Golay filter 濾波平滑組合的光譜預(yù)處理后的亞硝酸鈉光譜模型Rc、RP值更接近于1,但由于其主因子數(shù)為10,主成分?jǐn)?shù)過大,會出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象[21],大大降低模型的穩(wěn)定性和預(yù)測能力,故不為最優(yōu)建模選擇。如圖12～圖16分別為利用主成分回歸法(PCR)比較無預(yù)處理、一階微分處理(1D)、二階微分處理(2D)、Savitzky-Golay filter 濾波平滑互相組合后的建模效果,如表3從五種數(shù)據(jù)比較分析,整體比較PLS方法RSMEC,RMSEP較大,Rc、RP較小,故PCR建模效果較PLS稍差,故本實驗采用一階微分(1D)、Savitzky-Golay filter 濾波平滑組合的方式建立光譜模型。榨菜樣品模型中亞硝酸鹽近紅外光譜建模主要參數(shù)及評價指標(biāo)如表4。

表1 兩種建模方法在不同預(yù)處理下的數(shù)據(jù)比較Table 1 Data comparison of two modeling methods under different preprocessing

表2 榨菜中亞硝酸鹽含量預(yù)測值與實測值比較Table 2 Comparison between the predicted and measured values of nitrite content in pickled mustard

表3 F-檢驗雙樣本方差分析Table 3 F-test two-sample analysis of variance

表4 T-檢驗雙樣本等方差假設(shè)Table 4 T-test two-sample equal variance hypothesis

圖7 PLS模型的校正集和預(yù)測集無預(yù)處理預(yù)測值與實測值的關(guān)系Fig.7 Relationship between the correction set and the prediction set of the PLS model without preprocessing and the true value

圖8 PLS模型的校正集和預(yù)測集經(jīng)一階微分處理后預(yù)測值與實測值的關(guān)系Fig.8 Relation between the predicted value and the true value after the first order differential treatment of the correction set and the prediction set of the PLS model

圖9 PLS模型的校正集和預(yù)測集經(jīng)一階微分處理+Savitzky-Golay filter濾波平滑后預(yù)測值與實測值的關(guān)系Fig.9 Relation between the corrected set and the prediction set of the PLS model after the first order differential processing of the +Savitzky-Golay filter smoothing the prediction value and the true value

圖10 PLS模型的校正集和預(yù)測集經(jīng)二階微分處理后預(yù)測值與實測值的關(guān)系Fig.10 Relation between the predicted value and the true value of the correction set and the predictive set of the PLS model after the two order differential treatment

圖11 PLS模型的校正集和預(yù)測集經(jīng)二階微分處理 +Savitzky-Golay filter濾波平滑后預(yù)測值與實測值的關(guān)系Fig.11 Relationship between the predicted set and the predictive set of the PLS model after the two order differential processing+Savitzky-Golay filter filter smoothing the prediction value and the true value

圖12 PCR模型的校正集和預(yù)測集無預(yù)處理預(yù)測值與實測值的關(guān)系Fig.12 Relationship between the correction set and the prediction set of the PCR model without preprocessing and the true value

圖13 PCR模型的校正集和預(yù)測集經(jīng)一階微分處理后預(yù)測值與實測值的關(guān)系Fig.13 Relation between the predicted value and the true value after the first order differential treatment of the correction set and the prediction set of the PCR model

圖14 PCR模型的校正集和預(yù)測集經(jīng)一階微分處理+Savitzky-Golay filter濾波平滑后預(yù)測值與實測值的關(guān)系Fig.14 Relation between the corrected set and the prediction set of the PCR model after the first order differential processing of the+Savitzky-Golay filter smoothing the prediction value and the true value

圖15 PCR模型的校正集和預(yù)測集經(jīng)二階微分處理后預(yù)測值與實測值的關(guān)系Fig.15 Relation between the predicted value and the true value of the correction set and the predictive set of the PCR model after the two order differential treatment

圖16 PCR模型的校正集和預(yù)測集經(jīng)二階微分處理+ Savitzky-Golay filter濾波平滑后預(yù)測值與實測值的關(guān)系Fig.16 Relationship between the predicted set and the predictive set of the PCR model after the two order differential processing+Savitzky-Golay filter smoothing the prediction value and the true value

2.5 近紅外光譜預(yù)測值與國標(biāo)法測得實際值比較

建立近紅外優(yōu)選模型后,將未參與建模的10個預(yù)測樣組成的預(yù)測集代入模型進行預(yù)測,同時與國標(biāo)法測得的實際值進行比較,驗證優(yōu)選模型的準(zhǔn)確性,其中每個預(yù)測樣品掃描3次,取平均光譜作預(yù)測光譜,環(huán)境溫度25 ℃。國標(biāo)法測定的實際值測兩次取平均值,對比結(jié)果見表5。

為檢驗所建模型的預(yù)測能力,對兩組數(shù)據(jù)進行F檢驗。偏最小二乘法(PLS)是通過建立光譜數(shù)據(jù)與亞硝酸鈉濃度分類值之間的多元統(tǒng)計回歸模型,對于二元以上的多元回歸模型[22],解釋變量的整體對被解釋變量的影響是顯著的,并不表明每一個解釋變量對它的影響都顯著。因此在做完F檢驗后還須進行t檢驗[23]。

如表3所示,F檢驗結(jié)果1.349245>1,為右側(cè)檢驗,F<“F單尾臨界”,P(F≤f)單尾=0.33133>0.05,兩組數(shù)據(jù)(化學(xué)實測值,模型預(yù)測值)精密度無顯著差異。根據(jù)方差檢驗結(jié)果,檢驗平均值時采用等方差t檢驗由于|t|<“t雙尾臨界”,“P(T<=t)雙尾”>0.05,所以兩平均值之間無顯著差異[24]。分析上表中各列標(biāo)準(zhǔn)差小于3,表明大部分?jǐn)?shù)值與平均值差異較小,即離散度較小,模型較穩(wěn)定且準(zhǔn)確性較好[25],根據(jù)上表的化學(xué)實測值,模型預(yù)測值,計算光譜模型相關(guān)系數(shù)R=0.9378相關(guān)系數(shù)較高說明模型預(yù)測能力較好。

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明經(jīng)一階微分、Savitzky-Golay filter濾波平滑(17點2次)和偏最小二乘法(PLC)組合建模效果最優(yōu),內(nèi)部交叉驗正均方差(RSMECV)、外部預(yù)測均方根誤差(RMSEP)、交叉驗證決定系數(shù)(Rc)、預(yù)測決定系數(shù)(Rp)依次為:0.0310、0.0141、0.9720、0.9925,國標(biāo)法測量亞硝酸鹽的實測值與近紅外定標(biāo)模型預(yù)測值之間的Rc=0.9720>0.96,RMSECV與 RMSEP數(shù)值均小于0.1,說明FNIR光譜數(shù)學(xué)模型的預(yù)測值與國家標(biāo)準(zhǔn)法的實際測量值有高度的相關(guān)性,將近紅外樣本預(yù)測集與國標(biāo)法實測數(shù)據(jù)進行對比,根據(jù)F檢驗與T檢驗的結(jié)果表明兩種數(shù)據(jù)測量結(jié)果無顯著性差異,即本實驗的FNIR數(shù)學(xué)模型能夠預(yù)測榨菜中亞硝酸鹽的含量。