(漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院,福建漳州 363000)

黃槿(Hibiscustiliaceus)又名糕仔樹、海麻桐、木麻、黃木槿和桐花等，為錦葵科木槿屬植物[1]。黃槿耐堿、耐熱、耐瘠、耐旱、抗風(fēng)、萌芽強(qiáng)、易移植,主要生長于我國的廣東、福建、臺灣、海南和廣西等沿海省區(qū)的沿海岸或潮水能到達(dá)的河岸上[2-3]。黃槿葉是一種潛在的食用和藥用植物,逐漸受到了人們的關(guān)注,張小坡等[4]采用柱色譜對黃槿枝葉70%乙醇提取物進(jìn)行了分離,得到14個(gè)化合物,李曉菲等[5]利用氣-質(zhì)聯(lián)用儀對黃槿葉片的揮發(fā)油和脂肪酸進(jìn)行了測定,得到酚類、醛酮類、醇類等54種化合物。黃酮是一種廣泛存在于植物體中含有C6-C3-C6基本骨架的一類天然高分子化合物,具有抗氧化、抗炎、抗癌、降血脂、治療心腦血管疾病等多種生理與保健功能[6]。迄今為止,尚未有對黃槿葉總黃酮的提取工藝及活性的系統(tǒng)研究。本文以漳州產(chǎn)黃槿葉為原料,研究了黃槿葉的超聲波輔助提取工藝,并對總黃酮對亞硝酸鹽的清除作用進(jìn)行了探討,以期為漳州黃槿葉資源的開發(fā)與利用提供可行性的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃槿葉 采于漳州市九湖公園;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 上海滬宇生物試劑公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

KQ-100DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;UV-7504型紫外可見分光光度計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮的提取 用蒸餾水將采摘的黃槿葉洗凈,在25 ℃的室溫下晾干,后于50 ℃的干燥箱中干燥至恒重,用粉碎機(jī)粉碎,篩選60～80目的粉末備用。準(zhǔn)確稱取1.00 g的備用的黃槿葉粉末,裝入100 mL的圓底燒瓶中,加入一定體積和一定濃度的乙醇并搖勻,后置于超聲波清洗器中,在一定的溫度下,超聲提取一定的時(shí)間,提取結(jié)束后,定容至50 mL。

1.2.2 總黃酮含量的測定 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[7],在波長510 nm下繪制蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并線性回歸得方程y=7.6142x+0.0003,R2=0.9998。取在不同條件下所得的提取液進(jìn)行顯色并測試,代入回歸方程,求出黃槿葉總黃酮的得率。

式中:b為黃槿葉總黃酮質(zhì)量濃度,mg/L;V為提取液體積,L；m為稱取的黃槿葉質(zhì)量,g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 超聲溫度對總黃酮得率的影響 以超聲時(shí)間30 min、乙醇濃度60%(v/v,下同)和液料比30∶1 mL/g為固定水平,分別考察超聲溫度為40、50、60、70、80 ℃時(shí)對黃槿葉總黃酮得率的影響。

1.2.3.2 超聲時(shí)間對總黃酮得率的影響 以超聲溫度70 ℃、乙醇濃度60%和液料比30∶1 mL/g為固定水平,分別考察超聲時(shí)間為10、20、30、40、50 min時(shí)對黃槿葉總黃酮得率的影響。

1.2.3.3 乙醇濃度對總黃酮得率的影響 以超聲溫度70 ℃、超聲時(shí)間30 min和液料比30∶1 mL/g為固定水平,分別考察乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%時(shí)對黃槿葉總黃酮得率的影響。

1.2.3.4 液料比對總黃酮得率的影響 以超聲溫度70 ℃、超聲時(shí)間30 min和乙醇濃度60%為固定水平,分別考察液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g時(shí)對黃槿葉總黃酮得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果對影響黃槿葉總黃酮得率的超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)和液料比(D)四因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素編碼與水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平表Table 1 Factors and levels table of response surface methodology

1.2.5 總黃酮對亞硝酸鹽清除率的測定 分別在25 mL的具塞比色管中配制0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mg/L的黃槿葉總黃酮溶液,分別加入10.0 mL pH為3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液和1.0 mL 50 g/mL的NaNO2溶液,并置于37 ℃的水浴鍋中保溫1 h,保溫結(jié)束后,加入2.0 mL 0.4%(w/v)的對氨基苯磺酸,靜置5 min,再加入1.0 mL 0.2%(w/v)的鹽酸萘乙二胺,定容至25 mL,靜置15 min,在540 nm處測得吸光度A,黃槿葉總黃酮溶液濃度為0時(shí)的吸光度為A0,并以VC為對照,分別計(jì)算亞硝酸鹽的清除率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用Excel 2003、Origin 7.5和Design-Expert 8.05b進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析及圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲溫度對總黃酮得率的影響 由圖1可知,當(dāng)超聲溫度在40～70 ℃時(shí),隨著溫度升高,總黃酮得率也增大,這是因?yàn)闇囟壬?加快了溶劑與黃槿葉黃酮分子之間的溶解與滲透能力,使得總黃酮得率增大;但當(dāng)超聲溫度大于70 ℃時(shí),過高的超聲溫度會破壞部分不穩(wěn)定的黃酮分子結(jié)構(gòu)[8],造成得率降低。因此超聲溫度選擇為70 ℃。

圖1 超聲溫度對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on yield of total flavonoids

2.1.2 超聲時(shí)間對總黃酮得率的影響 由圖2可知,當(dāng)超聲時(shí)間為10～30 min時(shí),隨著超聲時(shí)間延長,總黃酮得率也增大,這是因?yàn)槌晻r(shí)間的延長,黃槿葉總黃酮能夠更充分地溶出,使得得率增大;但當(dāng)超聲時(shí)間大于30 min時(shí),過長的超聲時(shí)間作用下,黃槿葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)破損,胞內(nèi)其它雜質(zhì)溶出,并與黃酮產(chǎn)生溶出競爭[9],使得得率下降。因此超聲時(shí)間選擇為30 min。

圖2 超聲時(shí)間對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on yield of total flavonoids

2.1.3 乙醇濃度對總黃酮得率的影響 由圖3可知,當(dāng)乙醇濃度在40%～60%時(shí),隨著乙醇濃度增大,總黃酮得率也增大,這是因?yàn)橐掖紳舛鹊脑龃?溶劑的極性降低,使得溶劑極性與黃槿葉總黃酮的極性更加接近,促進(jìn)了黃槿葉總黃酮在溶劑中的溶解,使得得率增大;但當(dāng)乙醇濃度過大時(shí),極性較小的一些醇溶性雜質(zhì)會與黃酮產(chǎn)生溶出競爭[10],導(dǎo)致了總黃酮得率的下降。因此乙醇濃度選擇為60%。

圖3 乙醇濃度對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield of total flavonoids

2.1.4 液料比對總黃酮得率的影響 由圖4可知,當(dāng)液料比在10∶1～30∶1 mL/g時(shí),隨著液料比增大,總黃酮得率也增大,這是因?yàn)橐毫媳鹊脑龃?增加了黃槿葉總黃酮的絕對溶解能力,使得得率增大;但當(dāng)液料比過大時(shí),黃槿葉顆粒內(nèi)其他非黃酮類成分溶出量增大[11],導(dǎo)致了總黃酮得率的下降。因此液料比選擇為30∶1 mL/g。

圖4 液料比對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of liquid to material ratio on yield of total flavonoids

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 模型與方差分析 以黃槿葉總黃酮得率為響應(yīng)值,應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選擇超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)和液料比(D)為影響因素,得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2,超聲波輔助提取黃槿葉總黃酮得率數(shù)據(jù)模型的方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.2.2 模型的建立與分析 利用Design-Expert 8.05b軟件對表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到以超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)和液料比(D)為工藝參數(shù),黃槿葉總黃酮得率為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)式回歸方程:

Y=37.61+3.0A-0.46B-1.50C-1.18D-0.71AB-0.23AC+0.075AD-0.23BC-0.54BD+2.64CD-3.97A2-6.18B2-4.75C2-6.02D2

根據(jù)表3的響應(yīng)面方差分析可知,該回歸模型p<0.0001,說明該模型達(dá)到了極顯著水平;失擬項(xiàng)p=0.1241>0.05,不顯著,說明該模型的可信度較高,擬合度好。模型的決定系數(shù)R2=0.9181,說明該模型可靠,有91.81%的實(shí)驗(yàn)值可以利用預(yù)測值來描述。由方差F值及p值可知,影響黃槿葉總黃酮得率的因素中,其主次順序?yàn)槌暅囟?A)>乙醇濃度(C)>液料比(D)>超聲時(shí)間(B),其中超聲溫度的一次項(xiàng)A,超聲溫度的二次項(xiàng)A2、超聲時(shí)間的二次項(xiàng)B2、乙醇濃度的二次項(xiàng)C2和液料比的二次項(xiàng)D2對總黃酮得率影響極顯著(p<0.01);乙醇濃度的一次項(xiàng)C、乙醇濃度與液料比的二次交互項(xiàng)CD對總黃酮得率影響顯著(p<0.05);其他項(xiàng)對總黃酮得率影響不顯著(p>0.05)。

2.2.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面及等高線圖可以直觀地反映出黃槿葉總黃酮得率與所考察的超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)和液料比(D)四因素中兩兩交互作用之間的關(guān)系。利用Design-Expert 8.05b軟件繪制的響應(yīng)面和等高線圖如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對總黃酮得率的影響Fig.5 Effects of interactive of various factors on yield of total flavonoids注:(A,a):超聲時(shí)間和超聲溫度;(B,b):超聲溫度和乙醇濃度;(C,c):超聲溫度和液料比;(D,d):超聲時(shí)間和乙醇濃度;(E:e):超聲時(shí)間和和液料比;(F,f):乙醇濃度和和液料比。

由圖5(A,a)可知,超聲溫度和超聲時(shí)間的二次交互項(xiàng)AB對總黃酮得率的影響不顯著,總黃酮得率隨著超聲溫度的升高和超聲時(shí)間的延長均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢。由圖5(B,b)可知,超聲溫度和乙醇濃度的二次交互項(xiàng)AC對總黃酮得率的影響不顯著,總黃酮得率隨著超聲溫度的升高和乙醇濃度的增加均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢。由圖5(C,c)可知,超聲溫度和液料比的二次交互項(xiàng)AD對總黃酮得率的影響不顯著,總黃酮得率隨著超聲溫度的升高和液料比的增加均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢。由圖5(D,d)可知,超聲時(shí)間和乙醇濃度二次交互項(xiàng)BC對總黃酮得率的影響不顯著,總黃酮得率隨著超聲時(shí)間的延長和乙醇濃度的增大均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢。由圖5(E,e)可知,超聲時(shí)間和液料比二次交互項(xiàng)BD對總黃酮得率的影響不顯著,總黃酮得率隨著超聲時(shí)間的延長和液料比的增大均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢。由圖5(F,f)可知,乙醇濃度和液料比的二次交互項(xiàng)CD對總黃酮得率的影響顯著,當(dāng)乙醇濃度料小時(shí),液料比對總黃酮得率的影響較大,最初隨著乙醇濃度的增加,總黃酮得率迅速增大,而后隨著乙醇濃度的增加反而又開始下降。

2.2.4 最優(yōu)條件驗(yàn)證 根據(jù)響應(yīng)面方程進(jìn)行分析得到黃槿葉總黃酮的最佳提取工藝為:超聲溫度73.87 ℃,超聲時(shí)間29.50 min,乙醇濃度57.96%,液料比28.62∶1 mL/g,預(yù)測的總黃酮得率為38.43 mg/g。為了方便對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證,將優(yōu)化條件修正為超聲溫度74 ℃,超聲時(shí)間29 min,乙醇濃度58%,液料比29∶1 mL/g,并進(jìn)行3次平行試驗(yàn),得到黃槿葉總黃酮的得率為38.15 mg/g,與預(yù)測的相對誤差為0.73%,說明該回歸方程對黃槿葉總黃酮得率的預(yù)測準(zhǔn)確率高,可靠性強(qiáng),可推廣到實(shí)際生產(chǎn)中。

2.3 黃槿葉總黃酮對亞硝酸鹽的清除能力

由圖6可知,在0.2～3.0 mg/L范圍內(nèi),隨著濃度的增加,黃槿葉總黃酮對亞硝酸鹽的清除率逐漸增加,其IC50為1.87 mg/L,當(dāng)質(zhì)量濃度為3.0 mg/L時(shí),清除率達(dá)到69.58%,說明黃槿葉總黃酮與亞硝酸鹽的清除率之間存在量效關(guān)系,黃槿葉總黃酮具有較好的亞硝酸鹽清除能力,但效果弱于VC。

圖6 總黃酮和VC對亞硝酸鹽的清除率Fig.6 Nitrite scavenging rates of total flavonoids and VC

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)對影響黃槿葉總黃酮得率的因素進(jìn)行了分析,確定了合適的提取條件,結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助黃槿葉總黃酮的提取工藝。結(jié)果表明,影響黃槿葉總黃酮得率的各因素主次順序?yàn)槌暅囟?乙醇濃度>液料比>超聲時(shí)間,最佳提取工藝條件為:超聲溫度74 ℃,超聲時(shí)間29 min,乙醇濃度58%,液料比29∶1 mL/g,在此條件下黃槿葉總

黃酮的得率為38.15 mg/g,與預(yù)測的相對誤差為0.73%,說明該回歸方程對黃槿葉總黃酮得率的預(yù)測準(zhǔn)確率高,可靠性強(qiáng),且得到的黃槿葉總黃酮對具有較好的亞硝酸鹽清除能力。