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(1.湖南中醫(yī)藥大學藥學院,湖南長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學理學院,湖南長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學,獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)新國家地方聯(lián)合工程研究中心,湖南長沙 410128)

隨著科學技術(shù)及社會的發(fā)展,人民生活水平不斷提高,生活品質(zhì)不斷改善,食品結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。高熱量食品特別是糖類物質(zhì)的過量攝入引起的肥胖癥、糖尿病、齲齒、高血壓等疾病已成為一大社會問題,使得人們對新型甜味劑的開發(fā)越來越重視。廣西甜茶(RubussuavissmusS.Lee)是薔薇科懸鉤子屬的一種有刺灌木,含有一種無毒、高糖度、低熱能的甜味物質(zhì)——甜茶苷(Rubusoside),又稱甜葉懸鉤子苷、甜茶素[1-2]。甜茶苷甜度是蔗糖的300倍,具有降血糖[3]、降血脂[4]、防齲齒[5]等多種功效,在飲料、醫(yī)藥、糖果、護膚品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[6]。此外,甜茶葉中還存在含量較高的多酚類物質(zhì)[7]。甜茶多酚是高效的抗氧化劑[8],還具有抗過敏[9]、抗菌抗病毒[10]、提高免疫力[11]等多種作用。

目前文獻報道的甜茶中活性成分的提取方法主要有有機溶劑提取法、超聲提取法、微波提取法和酶解法等[12-15],甜茶中有效成分的提取研究已相對成熟,但多以提取單一成分或一類成分為主,關(guān)于甜茶中多種活性成分的同時提取工藝鮮有報道。

本文從資源的綜合利用、降低生產(chǎn)成本和適合規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的角度,選擇以水為溶劑同時提取甜茶苷和甜茶多酚,在單因素的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法對甜茶苷和甜茶多酚的同時提取工藝進行優(yōu)化,得到廣西甜茶中甜茶苷和甜茶多酚的提取最佳工藝參數(shù),為廣西甜茶的開發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

廣西甜茶干葉 由長沙世唯生物科技有限公司提供;甜茶苷標準品(HPLC>98%) 北京嘉世玉和化工技術(shù)研究院;沒食子酸標準品(≥98%)、福林酚試劑 上海源葉生物科技有限公司;乙腈(色譜純) 德國Merck公司;蒸餾水 實驗室自制;其余試劑 均為分析純。

Agilent 1260液相色譜儀 美國安捷倫科技公司;UVmini-1240型紫外可見分光光度計 日本島津公司;AUW220D型分析天平 日本島津公司;PL203電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;YB-1500A型高速多功能粉碎機 永康市速鋒工貿(mào)有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆明市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甜茶水提液的制備 將甜茶干葉粉碎,過30目篩,稱取5 g于250 mL錐形瓶中,加入一定量蒸餾水,置于磁力攪拌器中(100 r/min)于一定溫度下攪拌，提取一定時間后,抽濾,收集甜茶水提液。

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 甜茶苷的HPLC測定方法 a.色譜條件:選擇乙腈-水作為流動相,利用儀器的二極管陣列全波長紫外掃描功能進行掃描后得到的最大吸收值為205 nm,因此選擇205 nm為檢測波長。檢測器:Aglient 1260;色譜柱:Ultimate XB-C18(4.6×250 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;色譜乙腈和水的體積比為33∶67;流速:1.0 mL/min;檢測波長:205 nm;進樣量:10 μL。

b.標準溶液配制:精密稱取干燥恒重的甜茶苷5 mg,加適量蒸餾水溶解,轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,配成濃度為1 mg/mL的甜茶苷標準溶液,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩蚀_移取甜茶苷標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL,分別用蒸餾水定容至10 mL容量瓶中,得到濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL系列標準溶液,按上述色譜條件測定。以甜茶苷濃度(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線。

c.含量測定:移取1 mL甜茶苷水提液于25 mL容量瓶中,蒸餾水定容,搖勻。按上述色譜條件進行分析。由標準曲線得到待測液中甜茶苷的質(zhì)量濃度,并按公式(1)計算甜茶苷提取率。

式(1)

式中:X為待測溶液中甜茶苷濃度(mg/mL)；V為樣品溶液總體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；M為所取甜茶干粉中甜茶苷的總量(mg)。

1.2.2.2 甜茶多酚的測定方法 a.標準溶液配制:精密稱取干燥恒重的沒食子酸標準品5 mg,加適量蒸餾水溶解后定容至25 mL容量瓶中,再準確吸取5 mL,加蒸餾水稀釋至25 mL,搖勻,配成濃度為0.04 mg/mL的沒食子酸標準溶液,備用。準確移取沒食子酸標準溶液1、2、3、4、5 mL于25 mL棕色容量瓶中,加入1 mol/L Folin-Ciocalteu試劑2 mL和15% Na2CO3溶液7.5 mL,以蒸餾水定容至刻度,配制成1.6×10-3、3.2×10-3、4.8×10-3、6.4×10-3、8.0×10-3mg/mL系列標準溶液,30 ℃下靜置1 h,在波長770 nm處測定吸光度。以甜茶多酚濃度(x)為橫坐標,峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線。

b.含量測定:精確吸取甜茶多酚水提液1 mL于25 mL棕色容量瓶中,加入1 mol/L Folin-Ciocalteu試劑2 mL和15% Na2CO3溶液7.5 mL,以蒸餾水稀釋至刻度,30 ℃下靜置1 h。測定到顯色,在波長770 nm處測定吸光度。根據(jù)標準曲線計算出甜茶多酚濃度,按公式(2)計算水提液中甜茶多酚提取率。

式(2)

式中:c為水提液中甜茶多酚濃度(ug/mL);v為樣品溶液總體積(mL);n為稀釋倍數(shù);m為所取甜茶干粉中總多酚的總量(mg)。

1.2.3 甜茶葉中甜茶苷及甜茶多酚的總量的檢測 精密稱取3份5 g甜茶(30目篩)粉末于250 mL錐形瓶中,加入130 mL蒸餾水,超聲提取(水浴溫度30 ℃,功率180 W)45 min,提取3次,抽濾得濾液,將濾液合并,按1.2.2測定方法檢測濾液中的甜茶苷和甜茶多酚的總量[16]。

1.2.4 甜茶水提單因素實驗 甜茶干葉粉(30目),選擇液料比為30∶1 mL/g,提取時間為30 min,考察提取溫度(10、30、50、70、90 ℃)對甜茶苷和甜茶總多酚提取率的影響;選擇提取溫度為70 ℃,提取時間為30 min,考察料液比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g)對甜茶苷和甜茶總多酚提取率的影響。選擇液料比為30∶1 mL/g,提取溫度為70 ℃考察提取時間(10、20、30、40、50 min)對甜茶苷和甜茶總多酚提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 以提取溫度(A)、液料比(B)和時間(C)為考察因素,以甜茶苷提取率和甜茶多酚提取率為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken的設(shè)計原理,采用Design-Expert 8.0.6軟件分別設(shè)計3水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗。實驗的水平編碼值見表1、表2。

表1 甜茶苷的響應(yīng)面實驗因素及水平Table 1 Levels and factors used in response surface methodology of rubusoside

表2 甜茶總多酚的響應(yīng)面實驗因素及水平Table 2 Levels and factors used in response surface methodology of total polyphenols in sweet tea

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均為平行三次后取平均值,采用Origin 8.5軟件和Design-Expert 8.0.6軟件進行實驗設(shè)計與統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的建立

2.1.1 甜茶苷的標準曲線 采用高效液相色譜法檢測水提液中甜茶苷的含量[17],獲得甜茶苷標準曲線方程，見公式(3)。

Y=5137.5X+27.01

式(3)

式中:X為甜茶苷質(zhì)量濃度(mg/mL);Y為所對應(yīng)的峰面積。相關(guān)系數(shù)R2=0.999,說明甜茶苷的濃度在0.02～0.1 mg/mL范圍內(nèi),甜茶苷濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2 甜茶多酚的標準曲線 采用Folin-Ciocalteu比色法測定水提液中甜茶多酚的含量[18]。獲得甜茶多酚的標準曲線方程，見公式(4)。

y=0.0999x+0.0952

式(4)

式中:x為多酚質(zhì)量濃度(以沒食子酸計)(mg/mL);y為對應(yīng)的吸光度;相關(guān)系數(shù)R2=0.997,說明甜茶多酚的濃度在1.6×10-3～8.0×10-3mg/mL范圍內(nèi),甜茶多酚濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.2 甜茶葉中甜茶苷及甜茶多酚的總量

按照1.2.3提取方法,當提取次數(shù)為3次時,甜茶粉末中甜茶苷和甜茶多酚已提取完全,測量5 g甜茶粉末中甜茶苷的總量M為207.5 mg(RSD=0.72%,n=3),甜茶多酚總量m為518.13 mg(RSD=1.23%,n=3)。

2.3 單因素對甜茶苷及多酚提取效果的影響

2.3.1 提取溫度對甜茶苷和甜茶多酚提取率的影響 由圖1可知,在溫度低于70 ℃時,甜茶苷的提取率隨溫度的升高明顯增加;當溫度達到70 ℃時,甜茶苷的提取率趨于穩(wěn)定。因此,選擇用70 ℃提取甜茶苷。甜茶多酚的提取率在10～50 ℃時急劇上升,之后下降并趨于平穩(wěn)?？赡茉蚴窃诘蜏胤秶鷥?nèi)隨著溫度的升高,甜茶多酚在水中的擴散加快;當溫度過高時,酚類物質(zhì)易被氧化,導致多酚提取率反而減少[19]。因此,選擇50 ℃為甜茶多酚的提取溫度。

圖1 提取溫度對甜茶苷和甜茶多酚提取率的影響Fig.1 Effects of extraction temperature on the extraction rate of rubusoside and polyphenols in sweet tea

2.3.2 液料比對甜茶苷和甜茶多酚提取率的影響 由圖2可知,在液料比低于25∶1 mL/g時,甜茶苷提取率隨著料液比的增加明顯增加;當液料比 25∶1 mL/g時,甜茶苷的提取率已達到30∶1 mL/g時的98.8%,即繼續(xù)增加提取溶劑對甜茶苷的溶出影響不大。從節(jié)約生產(chǎn)成本的角度考慮,本文選擇液料比為25∶1 mL/g提取甜茶苷。甜茶多酚的提取率隨料液比的增大而增加,特別是液料比20∶1 mL/g以下,甜茶多酚提取率隨料液比的增大而增加明顯;當液料比超過20∶1 mL/g時,甜茶多酚提取率已達30∶1 mL/g時的95.8%,繼續(xù)增加溶液多酚的溶出的效果不再明顯[20];因此,選擇20∶1 mL/g為提取甜茶多酚的料液比。

圖2 料液比對甜茶苷和甜茶多酚提取率的影響Fig.2 Effects of liquid-material ratio on the extraction rate of rubusoside and polyphenols in sweet tea

2.3.3 提取時間對甜茶苷和總多酚提取率的影響 由圖3可知,隨著提取時間的增加,甜茶苷的提取率逐漸提高,特別是30 min以下,甜茶苷提取率增加明顯。而當提取時間超過30 min時,甜茶苷提取率的曲線變化不明顯,這是由于此時甜茶苷已被大部分溶出,繼續(xù)增加溶液甜茶苷的溶出的效果不再明顯。因此,選擇30 min為甜茶苷的提取時間。在提取溫度為50 ℃時,提取時間30 min以內(nèi),水提液中甜茶多酚顯著增加(p<0.05);當提取時間超過30 min后,甜茶多酚的提取率反而逐漸降低。這是由于甜茶粉末中的酚類物質(zhì)在30 min時就已提取完全,隨著提取時間的增加,酚類物質(zhì)受光熱等條件的影響被氧化分解,導致結(jié)構(gòu)改變進而含量降低[21],因此選擇30 min為甜茶多酚的提取時間。

圖3 提取時間對甜茶苷和甜茶多酚提取率的影響Fig.3 Effects of extraction time on the extraction rate of rubusoside and polyphenols in sweet tea

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化甜茶提取工藝

2.4.1 甜茶苷的響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果與分析 響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表3。應(yīng)用Design-Expert.8.0.6軟件對所得的實驗數(shù)據(jù)進行方差分析,得到回歸模型方差分析結(jié)果,見表4;同時擬合得到的二次回歸方程為:甜茶苷提取率(%)=88.72+1.42A+2.95B+0.87C-1.19AB-0.26AC-0.36BC-7.13A2-6.03B2-5.21C2。

表4 水提甜茶苷的回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model for the extraction of rubusoside

表3 提取甜茶苷響應(yīng)面實驗設(shè)計方案與結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis for the extraction of rubusoside

根據(jù)回歸模型作出兩因素交互作用的響應(yīng)曲面圖和等高線圖,可以直觀的考察因素之間的交互作用對甜茶苷提取率的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取溫度和液料比對甜茶苷提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.4 Response surface and contour plot showing the interactive effects of temperature and liquid-material ratio on the extraction of rubusoside

響應(yīng)曲面坡度的陡峭程度反映各因素對響應(yīng)值的影響程度,等高線的密集形狀反映各因素交互作用的顯著程度。由圖4可知,液料比與提取溫度的響應(yīng)面坡度均陡峭,說明液料比與提取溫度對甜茶苷的提取率的影響均顯著(p<0.05),液料比的響應(yīng)面曲線坡度與提取溫度相比略陡,表明液料比對甜茶苷提取率的影響高于提取溫度;等高線呈橢圓形,表明液料比與提取溫度的交互作用顯著,上述結(jié)論與p值結(jié)果一致。

2.4.2 甜茶多酚的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及方差分析 響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表5。應(yīng)用Design-Expert.8.0.6軟件對所得的實驗數(shù)據(jù)進行方差分析,得到回歸模型方差分析結(jié)果見表6;同時擬合得到的二次回歸方程為:甜茶多酚提取率(%)=78.26+1.67A+5.21B+0.57C+1.07AB+0.77AC+0.15BC-5.20A2-0.047B2+0.60C2。

表6 水提甜茶多酚的回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance of regression model for the extraction of polyphenols in sweet tea

表5 提取甜茶多酚響應(yīng)面實驗設(shè)計方案與結(jié)果Table 5 Experimental design and results for response surface analysis for the extraction of polyphenols in sweet tea

由表6可知,模型F=2.80,p=0.0003<0.05,說明模型顯著;失擬項p=0.2083>0.05為不顯著,說明響應(yīng)曲面設(shè)計實驗擬合回歸方程具有顯著意義,該模型可以用于預測甜茶多酚的提取過程。表中一次項A達到顯著水平(p<0.05)、B達到極顯著水平(p<0.01),二次項A2達到極顯著水平(p<0.01),C、B2、C2、AB、AC和BC對甜茶多酚提取率的影響不顯著(p>0.05)。由F值可知,三種因素對甜茶多酚提取率的影響次序為B液料比>A提取溫度>C提取時間。

2.5 驗證實驗

通過響應(yīng)面法優(yōu)化實驗,回歸模型預測的甜茶苷水提工藝的最佳條件為:提取溫度71.57 ℃,液料比為26.17∶1 mL/g,提取時間為30.73 min。此條件下得到的甜茶苷提取率理論上可達89.15%?？紤]到實際操作的可行性,實際工藝條件為:提取溫度72 ℃,液料比為26∶1 mL/g,提取時間為31 min。在此條件下,甜茶苷提取率為89.16%(RSD=0.71%,n=3),與模型預測值相符。此時,甜茶多酚的提取率可達80.66%(RSD=1.45%,n=3)。

回歸模型預測的甜茶多酚水提的最佳條件為:提取溫度57.40 ℃,液料比為24.98∶1 mL/g,提取時間為36.31 min。此條件下得到的甜茶多酚提取率理論上可達84.57%?？紤]到實際操作的可行性,改進工藝條件為:提取溫度57 ℃,液料比為25∶1 mL/g,提取時間為36 min。在此條件下,甜茶多酚提取率為85.32%(RSD=1.42%,n=3),與預測值基本吻合,說明優(yōu)化實驗方案可行。此時,甜茶苷的提取率可達83.58%(RSD=2.24%,n=3)。

綜上,考慮到甜茶的綜合利用及能源的節(jié)約,選取提取溫度為57 ℃,液料比為25∶1 mL/g,提取時間36 min作為提取甜茶活性物質(zhì)的條件。

3 結(jié)論

本文利用甜茶干葉為原料,同時提取甜茶苷和甜茶多酚,采用響應(yīng)曲面法對甜茶苷和甜茶多酚的提取工藝進行了優(yōu)化。確定了單獨提取甜茶苷的最佳條件為:提取溫度72 ℃,液料比為26∶1 mL/g,提取時間為31 min,此條件下甜茶苷提取率達89.16%(RSD=0.71%,n=3),甜茶多酚提取率可達80.66%(RSD=1.45%,n=3)。單獨提取甜茶多酚的最佳條件為:提取溫度57 ℃,液料比為25∶1 mL/g,提取時間為36 min,此條件下甜茶多酚提取率達85.32%(RSD=1.42%,n=3),甜茶苷提取率達83.58%(RSD=2.24%,n=3)。從甜茶資源的綜合利用角度及能源的節(jié)約考慮,選擇后者作為提取參數(shù)。本文通過分別建立數(shù)學模型,模型均呈現(xiàn)顯著性,具有很好的預測性,為甜茶葉深加工和綜合利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。