唐逸豪，殷成哲，李 凱，李偉鑫，范春芳△

(1. 中國人民武警特色醫(yī)學中心藥劑科, 天津 300162; 2. 武警天津市總隊執(zhí)勤第一支隊勤務保障大隊衛(wèi)生隊藥師, 天津 300202；3. 江蘇總隊鎮(zhèn)江支隊勤務保障大隊衛(wèi)生隊軍醫(yī)，鎮(zhèn)江 212000；4. 武警后勤學院，天津 300300)

腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)是一種常見的腎臟疾病，其特征是腎小球濾過器滲漏，導致白蛋白丟失，形成蛋白尿[1]。蛋白尿作為NS的病理特點，不僅是一種腎損傷的進展和預后的標志，同樣也是一個重要的致病因素?；颊叱掷m(xù)的蛋白尿可導致隨后的氧化應激、炎癥，最終導致腎臟纖維化，使患者喪失腎功能。有文獻報道[2]細胞因子IL-2、IL-6、IL-12等在病情發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。阿奇霉素(azithromycin，Azm )是一種口服大環(huán)內(nèi)酯類耐酸抗菌藥物，有研究[3, 4]表明其具有抗炎和免疫調節(jié)功能，尤其是對細胞因子IL-2、IL-6、IL-12等具有調控作用。近期有文獻報道[5-8]，阿霉素 (adriamycin, ADR)可通過氧自由基、炎癥因子及膜脂過氧化等機制，誘導小鼠腎臟腎小球毛細血管通透性增加和腎小管萎縮，從而導致蛋白尿和高脂血癥[9]。這種阿霉素誘導的腎病模型在組織學和臨床上類似于人類腎病綜合征，可用于腎臟藥理學與病理學研究。因此，本實驗采用阿霉素與白蛋白誘導的小鼠腎病模型，觀察阿奇霉素對腎病小鼠的治療效果，并對其可能的保護機制進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

SPF級雄性BALB/c小鼠40只，8～10周齡，體重(20±2)g，由山東魯抗藥品公司提供，許可證號為SCXK(魯)2016-0013。

阿奇霉素(每片0.25 mg，H91417)購自輝瑞制藥有限公司；注射用鹽酸多柔比星(阿霉素，每支10 mg，130710)購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司；醋酸潑尼松(prednisone，Pdn)片(每片5 mg，130820)購自天津力生制藥股份有限公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(A7906)購自美國Sigama公司；IL-2、IL-12、IL-6 ELISA試劑盒，均購自南京生物建成有限公司。

1.2 阿霉素與白蛋白腎損害小鼠模型的建立

參考文獻方法[10]建立小鼠模型，小鼠隨機分為空白對照組(Ctrl組)、腎損害模型組(ADR+BSA組)、阿奇霉素治療組(Azm組)及醋酸潑尼松陽性對照組(Pdn組)，每組10只小鼠；ADR+BSA、AZM及Pdn三組每天尾靜脈注射9.8 mg·kg-1阿霉素，腹腔注射10 mg·kg-1血清白蛋白，一周5次，對照組注射生理鹽水，持續(xù)4周。

1.3 治療方案

模型制備后，AZM組每天灌胃給予62.5 mg·kg-1阿奇霉素，Pdn組每天灌胃給予12.5 mg·kg-1醋酸潑尼松，其余兩組灌胃給予等量生理鹽水，持續(xù)6周。

1.4 24 h尿蛋白檢測

實驗結束前一日，將小鼠置于代謝籠內(nèi)飼養(yǎng)，禁食不禁水，收集并記錄24 h尿量，并取少部分3 500 r·min-1離心10 min，使用全自動生化分析儀檢測每只大鼠24 h尿蛋白濃度、尿肌酐(Ucr)。24 h尿蛋白量=24 h尿蛋白濃度(mg·ml-1)×24 h尿量(ml)

1.5 血清生化指標檢測

實驗結束前，對每組小鼠進行眼眶取血，離心取血清，采用全自動生化分析儀直接法檢測并記錄血清總膽固醇(TC)、白蛋白(ALB)、血肌酐(Scr)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量。

1.6 內(nèi)生肌酐清除率計算

記錄每只小鼠體重，利用Ucr、Scr、尿量、體重計算內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)。肌酐清除率(ml·min-1·g-1)=(Ucr×每分鐘尿量)/(Scr×體重)。

1.7 血清免疫因子檢測

對“1.5”的血清采用ELISA法檢測血清中IL-2, IL-12, IL-6含量，酶標儀檢測吸光度值(OD值)，確定其濃度。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 24 h尿蛋白和肌酐定量檢測

24 h尿蛋白定量檢測結果與內(nèi)生肌酐清除率計算結果如表1所示。ADR+BSA組小鼠24 h尿蛋白定量顯著升高，Ccr顯著降低；經(jīng)過阿奇霉素治療后的小鼠，24 h蛋白定量相比于ADR+BSA組顯著降低，Ccr顯著升高。

Group24 h urine protein quantitative(mg)Ccr(ml·min-1·g-1)Ctrl9.01±0.871.48±0.23ADR+BSA198.24±30.24?0.21±0.09?Pdn47.44±8.53?#0.69±0.18?#Azm63.46±9.88?#△0.58±0.24?#

Ctrl: Blank control group; ADR+BSA: Renal damage model group; Azm: Azithromycin treatment group; Pdn: Prednisone acetate positive control group

*P<0.05vsCtrl;#P<0.05vsADR+BSA;△P<0.05vsPdn

2.2 血清生化指標檢測

血清生化指標結果如表2所示。與Ctrl組相比，ADR+BSA組小鼠血清中TC、Cr、LDL-C水平顯著升高(P<0.05)，HDL-C水平升高，ALB水平下降，提示小鼠腎臟損傷模型建立成功。Azm組與ADR+BSA組相比，TC、Cr、HDL-C、LDL-C水平顯著降低(P<0.05)，ALB顯著回升(P<0.05)；與Pdn組相比，阿奇霉素對ALB、Scr和HDL-C的影響與醋酸潑尼松相似，而對TC和LDL-C的降低效果較醋酸潑尼松更明顯(P<0.05)，該結果提示阿奇霉素對小鼠腎損傷具有治療效果。

Tab. 2 Results of serum biochemical n=10)

Ctrl: Blank control group; ADR+BSA: Renal damage model group; Azm: Azithromycin treatment group; Pdn: Prednisone acetate positive control group

*P<0.05vsCtrl;#P<0.05vsADR+BSA;△P<0.05vsPdn

2.3 血清免疫因子表達水平檢測

血清免疫因子水平如表3所示。相比于Ctrl組，ADR+BSA組小鼠IL-2、IL-12水平降低，IL-6水平增高(P<0.05)。Pdn和Azm組相較于ADR+BSA組，對免疫因子表達的影響均為IL-2、IL-12水平回升，IL-6的水平下降，且與Ctrl組水平仍有差距。結果提示，阿奇霉素對血清免疫因子表達的影響與醋酸潑尼松相似。

Group IL-2 IL-12 IL-6Ctrl970.6±49.332.13±2.5115.26±2.32ADR+BSA526.3±41.6?17.26±1.38?46.87±3.61?Pdn836.7±48.6?#25.33±4.11?#25.23±5.14?#Azm821.1±31.7?#28.22±9.21?#△24.97±3.11?#

*P<0.05vsCtrl;#P<0.05vsADR+BSA;△P<0.05vsPdn

3 討論

阿霉素與白蛋白誘導的腎臟損害是獲得性腎小球腎病的小鼠模型[11]，雖然對其機制尚不完全了解，但阿霉素可誘發(fā)類似于人類局灶性腎小球硬化的病理腎小球改變[12]，并在其持續(xù)作用下發(fā)展為終末期的腎衰竭。本文利用該模型探討了阿奇霉素在腎小球疾病治療中作用。24 h尿蛋白量、內(nèi)生肌酐清除率和血清生化指標結果顯示，阿霉素給藥后，ADR+BSA、Pdn、Azm組小鼠均出現(xiàn)腎病綜合征，其表現(xiàn)為嚴重的蛋白尿、低蛋白血癥、低肌酐清除率和高脂血癥。其原因為阿霉素可直接損傷足細胞[13-15]，導致蛋白尿和腎小球硬化，蛋白尿增多，進一步引發(fā)血漿白蛋白濃度降低，血漿滲透壓降低，腎小球濾過率降低。血清生化指標表明高脂血癥也是阿霉素腎病的主要特征之一。越來越多的證據(jù)表明，高脂血癥和腎脂毒性是腎臟損害的重要致病因素[16]，可能有助于阿霉素腎病的發(fā)展和進展。

文獻報道[17]蛋白尿的產(chǎn)生由多種炎癥因子介導，在腎病綜合征進展過程中隨Th1 /Th2平衡偏倚發(fā)生變化，故炎癥介質可能是造成腎臟損害的重要危險因素和啟動因素。血清免疫因子檢測結果顯示ADR+BSA組與Ctrl組相比，阿霉素誘導的腎病小鼠血清內(nèi)IL-2和IL-6的水平顯著升高，IL-12水平顯著降低，證實了Th1 /Th2在腎病發(fā)展中的變化；Azm組小鼠經(jīng)過阿奇霉素治療后，IL-2和IL-6的水平相對于ADR+BSA組降低、IL-12水平升高，表明阿奇霉素對腎病小鼠的Th1 /Th2平衡有調整作用，且與陽性對照藥物醋酸潑尼松相似。

綜上所述，本研究結果表明：尾靜脈注射阿霉素 9.8 mg·kg-1，同時再予以10 mg·kg-1的牛血清白蛋白，可以對BALB/c小鼠造成以蛋白尿、低蛋白血癥、低肌酐清除率和高脂血癥為特征的腎損傷。給予阿奇霉素，對腎損傷小鼠表現(xiàn)出一定的治療效果，在對24 h尿蛋白、內(nèi)生肌酐清除率、血清生化指標和免疫因子表達的影響上與醋酸潑尼松相似。雖然其確切的機制需要更多的研究，但為今后阿奇霉素在對免疫因子表達影響作用上的研究提供了一定的理論依據(jù)。