何鳳琴，向全麗，屈庚超，周登祥

(西安文理學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，西安市秦嶺天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)與抗癌類創(chuàng)新藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，基因工程實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710065)

絕大多數(shù)研究都是母嬰分離對(duì)嬰兒成年后行為的影響，然而，對(duì)于大多數(shù)的母性而言，與自己的嬰兒互動(dòng)是一個(gè)大有裨益和愉快的經(jīng)歷，可促進(jìn)母嬰依戀，不僅能夠確保對(duì)發(fā)育中的嬰兒最佳照顧，使嬰兒得以健康生長(zhǎng)，而且也能夠激發(fā)母性獎(jiǎng)賞系統(tǒng)，使母性產(chǎn)生愉悅的情緒，對(duì)生理健康產(chǎn)生積極效應(yīng)[1]。產(chǎn)后抑郁癥剝奪了母性與孩子一起共享天倫的樂(lè)趣，而這一疾病的發(fā)生是與女性生產(chǎn)之后體內(nèi)性激素的變化有關(guān)。

雌激素是一種情緒調(diào)節(jié)劑，雌激素受體β (estrogen receptor β，ERβ)分布在與情緒相關(guān)的腦區(qū)，如杏仁內(nèi)側(cè)核(medial amygdaloid nucleus, MeA)，終紋床核(bed nucleus of the stria terminalis，BNST)，中視前區(qū)(medial preoptic area，mPOA)，雌激素在這些腦區(qū)通過(guò)受體對(duì)個(gè)體情緒產(chǎn)生重要影響[2]。大豆異黃酮(soy isoflavones)是大豆在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性雌激素相似性，具有類雌激素作用，植物雌激素的雌激素活性取決于它們與雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)或β的相互作用。在一定劑量下，植物雌激素可以選擇性地與ERβ相互作用，從而影響ERβ的表達(dá)[3]。一些研究認(rèn)為大豆異黃酮可作為一種治療藥物用于緩解與絕經(jīng)相關(guān)的生理和情緒變化，但另有一些研究認(rèn)為大豆異黃酮對(duì)不同時(shí)期不同性別社會(huì)性行為影響不一致。通過(guò)對(duì)嚙齒動(dòng)物研究表明終生攝入大豆可導(dǎo)致抗焦慮作用[4]，也有研究表明，大豆異黃酮可以減少抑郁相關(guān)的行為取決于大豆異黃酮飲入開(kāi)始時(shí)的年齡和卵巢狀態(tài)的變化[5]。然而異黃酮類分子如何調(diào)節(jié)大腦對(duì)抑郁樣行為影響機(jī)制還不清楚。本文以C57BL/6J小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)產(chǎn)后母嬰長(zhǎng)期分離使母鼠發(fā)生情緒變化，通過(guò)強(qiáng)迫游泳(Forced swimming test ，F(xiàn)ST) 和懸尾實(shí)驗(yàn)(Tail suspension test, TST)進(jìn)行行為測(cè)試。通過(guò)對(duì)具有抑郁樣行為母鼠食用一定時(shí)間的大豆異黃酮，探討異黃酮類分子如何調(diào)節(jié)大腦對(duì)抑郁樣行為影響的ERβ機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雌、雄C57BL/6J小鼠60只，體重28～33 g，由西安文理學(xué)院動(dòng)物中心提供，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究所。雌雄配對(duì)合籠放置于塑料鼠箱中(30 cm×20 cm×15 cm)，飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室鼠房，保持室溫 20～25℃和自然光周期 12L∶12D 。飼喂鼠飼料。飼養(yǎng)籠以鋸木作底物，棉花作巢材，正常撫養(yǎng)1 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 材料和設(shè)備

大豆異黃酮(HPLC ≥ 98%)購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司；雌激素Elisa試劑盒(CEA461Ge)和多巴胺Elisa試劑盒(CEA851Ge)購(gòu)自美國(guó)Meridian公司；一抗兔抗ERβ ( Sc28974) 購(gòu)自美國(guó)Santa cruz；二抗(羊抗兔) 和SABC(鏈酶親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物) 購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，DAB 為Sigma 分裝。強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)設(shè)備購(gòu)自深圳瑞沃德生物科技有限公司，酶標(biāo)儀(Bio-Tek，Winooski)購(gòu)自美國(guó)，冰凍切片機(jī)(CM1950)購(gòu)自德國(guó)萊卡公司，尼康顯微鏡及尼康相機(jī)購(gòu)自日本東京。

1.3 動(dòng)物分組

將產(chǎn)后2 d母鼠隨機(jī)分為2 組，對(duì)照組(n=10)和長(zhǎng)期分離模型組(n=40)，對(duì)照組不給予任何刺激，長(zhǎng)期分離模型組母鼠給予從分娩第2日到第10日，母嬰每天8:00-11:00分離3 h的刺激，分離后再放回鼠籠繼續(xù)撫養(yǎng)后代。第11日通過(guò)母鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)中掙扎的時(shí)間、頻次和靜止的時(shí)間、頻次檢測(cè)行為學(xué)指標(biāo)以判斷造模是否成功。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

將沒(méi)有造模成功的10只母鼠排除，造模成功母鼠分成3組，加上對(duì)照組，共四組，分別是：(1)對(duì)照組(Control，n=10)：正常飲食，正常撫育后代；(2)模型組(Model，n=10)：從第12日每日早上用蒸餾水0.3 ml連續(xù)灌胃到21 d，共10 d，期間母嬰不分離；(3)低濃度組(Low dose，n=10): 從第12日每日早上用15 mg/kg·d-1大豆異黃酮溶液0.3 ml連續(xù)灌胃到21 d，共10 d，期間母嬰不分離；(4)高濃度組(High dose，n=10)：從第12日每日早上用30 mg/kg·d-1大豆異黃酮溶液0.3 ml連續(xù)灌胃到21 d，共10 d，期間母嬰不分離。隨著灌胃天數(shù)的增加，觀察到高濃度組母鼠對(duì)幼鼠的撫育時(shí)間逐漸延長(zhǎng)。灌胃24 h后，對(duì)母鼠進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.5 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test, FST)

將母鼠放入高20 cm，直徑15 cm的透明圓柱形玻璃缸中，保持水溫37℃，先適應(yīng)環(huán)境1 min后，再實(shí)驗(yàn)并記錄5 min，利用smart v.3.0軟件記錄分析掙扎的時(shí)間、頻次和靜止的時(shí)間、頻次。

1.6 懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspension test, TST)

將母鼠尾部固定，倒懸身體。將攝像設(shè)備放置在母鼠的正前方，先適應(yīng)1 min后，再實(shí)驗(yàn)并記錄5 min，利用smart v.3.0軟件分析掙扎的時(shí)間、頻次和靜止的時(shí)間、頻次。

1.7 Elisa測(cè)定血清雌二醇(estradiol，E2)和多巴胺(dopamine，DA)

行為實(shí)驗(yàn)2 d后，在8:00-10:00之間，從麻醉的母鼠眼眶后竇收集血液(戊巴比妥鈉劑量為4 mg/kg體重)。血清樣本在室溫下以606 g的相對(duì)離心力(RCF)離心10 min將血清與血細(xì)胞分離，棄去血細(xì)胞，血清在-80℃冰箱儲(chǔ)存。E2和DA濃度使用Elisa試劑盒測(cè)定。首先，將制備的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分別放入板皿中，在37℃下溫育30 min。其次，用洗滌溶液洗滌平板皿四次，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)- 混合劑在37℃溫育30 min。最后，在將培養(yǎng)皿洗滌四次后，培養(yǎng)皿浸入彩色顯影劑A和B中，在37℃溫育15 min后，反應(yīng)被終止液停止。使用酶標(biāo)儀在450 nm下測(cè)量光密度，并將空白設(shè)定為零。重復(fù)值之間的差異小于5%。

1.8 免疫組化檢測(cè)部分腦區(qū)ERβ

收集血清后，由左心室注入0.1 mol PBS 150 ml，同時(shí)右心房放血，灌注4 %多聚甲醛300 ml 進(jìn)行前固定，小心取腦入4 %多聚甲醛后固定3 h (4℃) ，再浸入30 %的蔗糖溶液過(guò)夜待沉底。OCT 冰凍包埋劑包埋后冰凍切片，切片厚40 μm。切片首先在正常羊血清37 ℃孵育15 min 進(jìn)行封閉，然后入一抗ERβ(1∶100)，4℃孵育72 h，0.01 mol PBS沖洗3次，每次3 min，再分別于二抗和SABC 中37℃孵育30 min，0.01 mol PBS 沖洗3次，每次3 min，滴加DAB 顯色劑顯色10～30 min后在0.01 mol PBS中漂洗后貼片，風(fēng)干，梯度酒精中脫水，封片。用0.01 mol PBS代替一抗ERβ作為陰性對(duì)照，其他實(shí)驗(yàn)步驟同上。

在定量分析之前，將制好的玻片隨機(jī)編號(hào)，由不知實(shí)驗(yàn)方案的實(shí)驗(yàn)員分析。使用網(wǎng)格隨機(jī)在(200×200 μm2)標(biāo)準(zhǔn)面積下采樣，用眼定量數(shù)免疫反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量。ERβ-免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)(ERβ-immunoreactive neurons，ERβ-IRs) 在MeA，BNST和mPOA的 200×200 μm2的區(qū)域中計(jì)算。選擇這些大腦區(qū)域是因?yàn)樵贛eA，BNST，mPOA中發(fā)現(xiàn)了大量ERβ，并且與情緒活動(dòng)有關(guān)[6]。根據(jù)尼氏染色和小鼠腦立體定位圖集確定確定三個(gè)腦區(qū)位置[7]。

對(duì)于每個(gè)腦區(qū)，從前到后選擇三個(gè)代表性切片，通過(guò)計(jì)數(shù)陽(yáng)性神經(jīng)元(棕黃色點(diǎn)狀，核染色)獲得每個(gè)動(dòng)物的平均值。所有免疫組化過(guò)程也包括未添加一抗的陰性對(duì)照。用連接到尼康顯微鏡的尼康相機(jī)對(duì)選擇部分進(jìn)行拍攝。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大豆異黃酮對(duì)母鼠在FST和TST中的影響

與對(duì)照組比較，模型組和低濃度組在強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)動(dòng)時(shí)間和頻次明顯降低(P<0.05或P<0.01)，模型組不動(dòng)時(shí)間和頻率明顯升高(P<0.05或P<0.01)，低濃度組除了不動(dòng)頻次沒(méi)有明顯差異外(P>0.05)，不動(dòng)時(shí)間也明顯升高(P<0.05或P<0.01)，而高濃度組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與模型組比較，低濃度組除了在強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著升高(P<0.05)，在強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著性降低(P<0.05)，在懸尾實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)頻次明顯降低外(P< 0.01)，其他無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而高濃度組在強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)時(shí)間和頻次均明顯升高(P<0.05或P< 0.01)，不動(dòng)時(shí)間和頻次均明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與低濃度組比較，高濃度組在強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)時(shí)間和頻次均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，在強(qiáng)迫游泳中不動(dòng)時(shí)間明顯降低(P<0.01)，其他無(wú)顯著性差異(P>0.05，表1，表2) 。表明長(zhǎng)期分離導(dǎo)致母鼠產(chǎn)生產(chǎn)后抑郁樣行為，大豆異黃酮可減少母鼠的抑郁樣行為，較高濃度的大豆異黃酮減少的更為明顯。

Tab. 1 Effects of soy isoflavones on female mice in FST n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsthe control group;#P<0.05,##P<0.01vsthe model group;△△P<0.01vsthe low dose group

Tab. 2 Effects of soy isoflavones on female mice in TST n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsthe control group;#P<0.05,##P<0.01vsthe model group;△P<0.05,△△P<0.01vsthe low dose group

2.2 大豆異黃酮對(duì)母鼠血清E2和DA的影響

在ELISA實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，模型組、低濃度組和高濃度組血清中E2濃度明顯降低(P<0.01)，且三組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；然而，大豆異黃酮可使母鼠DA的水平增加，表現(xiàn)為與對(duì)照組比較，模型組和低濃度組明顯降低(P<0.01)，而高濃度組無(wú)明顯差異(P>0.05)；與模型組和低濃度組比較，高濃度組DA水平明顯增加(P<0.01)，模型組和低濃度組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05，表3)。表明具有抑郁樣行為母鼠血清中雌二醇明顯減少，大豆異黃酮并未使血清中雌二醇增加，較高濃度的大豆異黃酮使 DA增加明顯。

2.3 大豆異黃酮對(duì)母鼠ERβ表達(dá)的影響

大豆異黃酮對(duì)ERβ-IRs有重要影響。與對(duì)照組比較，ERβ-IRs在模型組和低濃度組MeA，BNST和mPOA明顯降低(P<0.05或P<0.01)，在高濃度組這三個(gè)腦區(qū)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；與模型組比較，除低濃度組在mPOA顯著性多外(P<0.05)，其他兩個(gè)腦區(qū)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，高濃度組MeA，BNST和mPOA均顯著多于模型組(P<0.01)；與低濃度組比較，高濃度組MeA(P<0.05)，BNST(P<0.01)和mPOA(P<0.01)均顯著多于低濃度組(圖1，表4)。表明具有抑郁樣行為母鼠ERβ在腦區(qū)明顯減少，大豆異黃酮使抑郁樣行為母鼠腦區(qū)ERβ明顯增加，較高濃度的大豆異黃酮使ERβ增加更明顯。

GroupE2 DAControl1339.91±29.4879.76±4.63Model 800.37±259.23??20.78±3.76??Low dose749.37±263.56??30.64±4.56??High dose700.23±236.21??67.83±8.23##△△

E2： Estradiol; DA: Dopamine

**P<0.01vsthe control group;##P<0.01vsthe model group;△△P<0.01vsthe low dose group

Fig. 1 Effects of soy isoflavones on the expression of ERβ in female mice(×200)

MeA: Medial amygdaloid nucleus; BNST: Bed nucleus of the stria terminalis; mPOA: Medial preoptic area

Group MeA BNST mPOAControl42.24±3.5933.57±4.2345.26±4.13Model20.36±2.6??20.12±2.62?20.31±2.15??Low dose24.26±3.57?22.24±2.42?32.22±3.15??#High dose44.57±5.12##△34.13±3.57##△△43.13±3.59##△△

*P<0.05,**P<0.01vsthe control group;#P<0.05,##P<0.01vsthe model group;△P<0.05,△△P<0.01vsthe low dose group

3 討論

本次研究發(fā)現(xiàn)具有抑郁樣行為的母鼠連續(xù)灌胃10 d高濃度大豆異黃酮時(shí)，在強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)中活動(dòng)持續(xù)時(shí)間和頻次明顯高于模型組，與情緒相關(guān)的腦區(qū)MeA，BNST和mPOA ERβ明顯升高，血清中DA明顯升高。表明母嬰分離加重了產(chǎn)婦的負(fù)面情緒，產(chǎn)生較高程度的抑郁樣行為，而較高濃度的大豆異黃酮能夠減少抑郁樣行為與大豆異黃酮使血清中DA升高，腦區(qū)ERβ增加有關(guān)，且抑郁樣行為的減少與大豆異黃酮濃度有相關(guān)性。

母鼠撫育子代10 d后與子代和雄鼠長(zhǎng)期分離，母鼠表現(xiàn)明顯的抑郁樣行為，即出現(xiàn)產(chǎn)后抑郁，與他人的研究結(jié)果相似：在大鼠，產(chǎn)后每天分離3 h，母鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為抑郁樣行為[8]。母嬰構(gòu)成不可分割二聚體[8]，母親和同窩仔鼠構(gòu)成個(gè)體社會(huì)環(huán)境的重要成分，提供如營(yíng)養(yǎng)、熱量、軀體感覺(jué)、動(dòng)覺(jué)、嗅覺(jué)及聽(tīng)覺(jué)刺激等重要資源。母嬰長(zhǎng)期分離，不僅對(duì)幼鼠代表嚴(yán)重的環(huán)境剝奪[9]，同時(shí)對(duì)母鼠也是嚴(yán)重的環(huán)境剝奪，母鼠表現(xiàn)出焦慮甚至抑郁樣行為，這些行為變化與控制母體行為的大腦區(qū)域的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的改變有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)就證明母鼠產(chǎn)生的抑郁樣行為與血清中E2水平及腦區(qū)MeA，BNST和mPOA的ERβ明顯下降有關(guān)，這一結(jié)果也與他人的研究結(jié)果一致：產(chǎn)后抑郁組雌激素下降值明顯高于對(duì)照組[10]。他人和我們前期研究已經(jīng)證實(shí)MeA，BNST和mPOA是調(diào)節(jié)抑郁等情緒相關(guān)的腦區(qū)[6]，E2可以和這些腦區(qū)的ERβ直接結(jié)合，發(fā)揮調(diào)整抑郁樣行為的作用。給予卵巢切除的大鼠注射E2，E2可通過(guò)與腦區(qū)ERβ受體結(jié)合而發(fā)揮抗抑郁作用[11]。母子的長(zhǎng)期分離導(dǎo)致E2和ERβ降低，可能與母嬰分離的應(yīng)激誘發(fā)的應(yīng)激激素過(guò)度分泌，抑制垂體促性腺激素分泌，降低性激素合成酶活性，進(jìn)而抑制卵巢產(chǎn)生性激素有關(guān)[10]。本研究還發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期分離使血清中DA水平顯著低于對(duì)照組，這與酈錚錚等研究結(jié)果相似[12]。DA是產(chǎn)生欣快感的重要神經(jīng)遞質(zhì)，與獎(jiǎng)賞和情緒控制有關(guān)，DA 系統(tǒng)參與情緒相關(guān)的調(diào)控，它是調(diào)解情緒神經(jīng)回路中的關(guān)鍵因素[13]。雌激素可在垂體、下丘腦、黑質(zhì)一紋狀體和中腦邊緣系統(tǒng)等水平影響DA 能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的功能，從而影響神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)生殖和非生殖行為的控制，而對(duì)中腦邊緣系統(tǒng)DA的調(diào)節(jié)，可能在心理障礙發(fā)生中起重要作用[14]。本次實(shí)驗(yàn)具有抑郁樣行為的模型組E2水平下降，DA也下降進(jìn)一步證實(shí)了內(nèi)源性雌激素水平對(duì)中腦邊緣系統(tǒng)DA活性的調(diào)節(jié)作用。雌激素可作用于DA 轉(zhuǎn)運(yùn)體上的特殊位點(diǎn)減少轉(zhuǎn)運(yùn)，也可直接或間接影響D2DA自身受體，使自身受體親合力下降，最終抑制重?cái)z取，減少清除率，增加DA釋放量[14]。

令人感興趣的是，雖然母鼠撫育子代10 d后與子代和雄鼠分離，但是經(jīng)過(guò)連續(xù)灌胃10 d大豆異黃酮，特別是高濃度組，母鼠在懸尾實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)時(shí)間和頻次明顯高于模型組和低濃度組，尤其是在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中與這兩組差別極大，一方面說(shuō)明大豆異黃酮可能使抑郁樣行為明顯減少，另一方面也可能是與大豆異黃酮對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠能量代謝具有一定的調(diào)節(jié)作用有關(guān)[15]。低和高濃度組血清中的E2比模型組降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明15或30 mg/kg·d-1大豆異黃酮溶液對(duì)E2有一定的抑制作用，這種趨勢(shì)與劉兆平等[16]以及周志軍等[17]報(bào)道的大豆異黃酮能顯著增加大鼠血清中E2的研究結(jié)果相反，但與盛微等報(bào)道的相似[18]。這可能是由于大豆異黃酮是一種與E2結(jié)構(gòu)相似的植物性雌激素，它能與C57BL/6J母鼠體內(nèi)E2受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而反饋性調(diào)節(jié)，導(dǎo)致母鼠體內(nèi)E2濃度降低[19]。雖然灌胃大豆異黃酮使血清中的E2比對(duì)照組降低，但MeA，BNST和mPOA ERβ明顯升高，可能大豆異黃酮進(jìn)入機(jī)體后與雌激素受體ERβ相結(jié)合并刺激ERβ的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而ERβ的數(shù)量增加并調(diào)節(jié)動(dòng)物的行為[20]，使抑郁樣行為減少。

在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)連續(xù)灌胃10 d大豆異黃酮，主要是高濃度組血清中的DA也明顯增多，可能與大豆異黃酮可在中樞發(fā)揮類雌激素作用，通過(guò)腦內(nèi)經(jīng)典的核內(nèi)受體或膜甾類受體對(duì) DA的功能活動(dòng)發(fā)揮著基因組和非基因組的調(diào)節(jié)作用，使杏仁核DA能神經(jīng)元釋放增多[14]，對(duì)于本實(shí)驗(yàn)中大豆異黃酮對(duì)雌鼠 DA 釋放調(diào)節(jié)的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。