馬科鋒，楊樹廣，劉少君

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850)

骨折治療常用的策略是在骨內(nèi)植入骨釘進行內(nèi)固定，但是僅憑這種方法治愈緩慢[1-3]。骨折愈合過程是骨生成和骨吸收相互作用的過程，骨愈合時軟骨細胞首先纖維化形成軟愈傷組織、軟骨細胞外基質(zhì)礦化，隨后在成骨細胞調(diào)節(jié)下形成編織骨，破骨細胞清除未成熟的編織骨和軟骨基質(zhì)直至形成具有力學(xué)穩(wěn)定性的成熟骨[4]。因此加速骨生成可能是治療骨丟失疾病的關(guān)鍵。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)是由349個氨基酸組成的富含半胱氨酸的分泌蛋白，屬于CCN蛋白家族成員之一[5]。CTGF參與多種細胞事件，包括血管生成、傷口愈合和骨生成[6]，相繼發(fā)現(xiàn)其在牙齒、軟骨和骨骼中廣泛表達[7-9]。本實驗室前期采用小RNA(miRNA)干預(yù)成骨細胞，并通過轉(zhuǎn)錄組測序進行分析，發(fā)現(xiàn)CTGF基因表達顯著降低，說明CTGF可能是miRNA調(diào)控的下游基因。因此深入研究CTGF對骨組織的調(diào)控作用對以骨吸收為主要特征的疾病的治療具有重要價值。

1 材料與方法

1.1 材料

SaOS-2、人腎上皮細胞系(293T)購于美國模式培養(yǎng)物研究所(ATCC)細胞庫，由本實驗室凍存?zhèn)鞔?；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(E.coli)、1Kb Plus DNA Marker購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI購于美國New England Biolabs公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、小量質(zhì)粒抽提試劑盒、脫氧核糖核酸(DNA)膠回收試劑盒購于美國promega公司；TreliefTMSoSoo Cloning Kit購于北京擎科生物技術(shù)有限公司；引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成；Lipofectamine 3000、酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉等試劑購于Invitrogen公司。

1.2 CTGF目的基因全長擴增

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)中人CTGF基因編碼區(qū)序列(CDS號為5151.1)及pcDNA3.1(+)載體多克隆位點信息，將目的基因插入pcDNA3.1(+)載體BamHI和XhoI酶切位點間，并擴增全長1 050 bp。分別設(shè)計上游引物序列為：5’-TACCGAGCTCGGATCCATGACCGCCGCCAGTATGG GC-3’、下游引物序列為：5’-AACGGGCCCTCTAGACTCGAGTCATGCCATGTCTCCGTACAT-3’。以293T細胞cDNA為模版，選取最佳PCR擴增條件：98°C 4 min；98℃ 10 s、60℃ 30 s、72℃ 60 s，40個循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μl 目的基因和陽性對照(凋亡信號調(diào)節(jié)激酶(ASK1)，該基因可以正確擴增出來以確保擴增體系無誤)PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析，無誤后進行目的基因產(chǎn)物回收和膠純化。

1.3 重組質(zhì)粒連接、提取及鑒定

將pcDNA3.1(+)-vector用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI進行雙酶切，跑膠純化回收后制備成線性化載體。分別將目的基因、陽性對照(TreliefTMSoSoo Cloning Kit試劑盒中自帶陽性基因)、陰性對照(雙蒸水)與載體按照摩爾比為5∶1的比例，采用TreliefTMSoSoo Cloning Kit進行片段與載體間的無縫連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli(DH5α)中，在不含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中于 37°C 震蕩培養(yǎng)1 h后涂板。經(jīng)氨芐青霉素固體培養(yǎng)皿篩選出含有pcDNA3.1-CTGF重組質(zhì)粒的E.coli，挑取5個陽性克隆，加入含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)17 h，觀察到菌體大量擴增后，按照Promega小量質(zhì)粒抽提試劑盒說明書提取質(zhì)粒，并將目的質(zhì)粒送公司測序，完成后將測序結(jié)果與目的基因序列進行比對。

1.4 細胞培養(yǎng)

SaOS-2細胞、293T細胞由含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，于37°C、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及實時熒光定量核酸擴增(qPCR)檢測

將SaOS-2細胞培養(yǎng)于6孔板中，當(dāng)細胞密度達70%～80%時，使用lipofectamine 3000 按照操作說明書步驟將成功構(gòu)建的1 μg pcDNA3.1-CTGF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SaOS-2細胞中，空白對照組僅以pcDNA3.1(+)-vector轉(zhuǎn)染至SaOS-2細胞，在細胞培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染6 h后棄去轉(zhuǎn)染混合液，添加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2遍后收集細胞，提取細胞內(nèi)總核糖核酸(RNA)，紫外分光光度計測定RNA樣本純度(A260/A280)在1.8-2.0之間，表示總RNA片段完整未降解可用。按照試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成互補脫氧核糖核酸(cDNA)。ABI StepOne PlusTMReal Time PCR測定細胞中CTGF基因表達水平，采用2-(△△Ct)方法進行分析。特異性上游引物序列為：GCCCAGACCCAACTATGATTAG，下游引物序列為：TCTCCGTACATCTTCCTGTAGT。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CTGF基因擴增凝膠電泳檢測

從NCBI上獲取CTGF基因全長，設(shè)計引物進行PCR擴增，擴增片段大小為1 050 bp。293T細胞作為轉(zhuǎn)染常用細胞，其所含目的基因豐度較高故用作提取CTGF cDNA進行擴增。結(jié)果如圖1所示，PCR產(chǎn)物凝膠電泳顯示目的條帶大小約為1 000 bp，與CTGF基因大小相符，表明成功擴增出了CTGF目的基因。對其進行切膠，回收產(chǎn)物。

Fig. 1 Electrophoresis of CTGF PCR products

M: DNA Marker; 1、2: CTGF gene; 3: Positive control

2.2 質(zhì)粒構(gòu)建及擴增

為了得到大量pcDNA3.1(+)-CTGF重組質(zhì)粒，將pcDNA3.1(+)-vector用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI酶切制備線性化載體，并與目的基因片段連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli(DH5α)中，涂板，經(jīng)氨芐青霉素篩選出含有目的基因CTGF重組質(zhì)粒的E.coli，培養(yǎng)結(jié)果如圖2所示，其中陰性對照組僅采用等比例線性載體與雙蒸水混合進行同源重組，其菌落產(chǎn)生可能是由于線性載體純化不充分或者存在載體自連情況。對CTGF菌落隨機挑取5個單克隆菌株，37°C振蕩培養(yǎng)17 h后提取質(zhì)粒。

Fig. 2 Transfection and filtration ofE.coli

A: CTGF colony; B: Positive control colony; C: Negative control colony

2.3 測序

對隨機挑取的5個單克隆質(zhì)粒進行雙向測序，拼接后與CTGF堿基進行比對，其中4個質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖3展示了測序結(jié)果的部分峰圖。與CTGF基因序列相比，擴增得到的序列基本正確，但是有3處堿基發(fā)生了突變(藍色堿基)(圖4 A)，可能是由于模版自身發(fā)生突變所致。為了確定該突變是否影響蛋白序列，經(jīng)過進一步比對發(fā)現(xiàn)，擴增得到的CTGF基因的蛋白序列與原基因的蛋白序列一致(圖4 B)，說明該處突變不影響CTGF蛋白功能，即成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-CTGF重組質(zhì)粒(圖3，圖4，見彩圖頁Ⅳ)。

2.4 CTGF基因信使RNA(mRNA)的轉(zhuǎn)錄情況

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-CTGF轉(zhuǎn)染到SaOS-2細胞中，48 h后檢測CTGF mRNA的表達情況。RT-PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)CTGF mRNA表達與對照組相比約上調(diào)4.8105倍(圖5)，具有顯著性統(tǒng)計差異(P<0.01)，進一步表明pcDNA3.1(+)-CTGF重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

**P

3 討論

軟骨細胞纖維化是骨重建的第一步，CTGF基因可能在該階段起重要作用。比如肋骨骨折模型小鼠結(jié)果顯示，骨折后第8日在骨折區(qū)域的肥大軟骨細胞和增殖軟骨細胞中檢測到CTGF基因表達增多，而第20日后同一區(qū)域的CTGF表達量下降，此時軟骨細胞形成的愈傷組織正向編織骨轉(zhuǎn)換[10]。Ivkovic S等[8]認(rèn)為CTGF介導(dǎo)細胞基質(zhì)中膠原沉積，CTGF基因突變會導(dǎo)致軟骨內(nèi)成骨受損，從而導(dǎo)致骨重構(gòu)缺陷。韓曉靜和崔茂香的研究指出，大鼠肺纖維化進程中伴隨CTGF的顯著表達，間接說明CTGF可能是通過促進軟骨細胞纖維化而促進骨愈合[11,12]。鑒于CTGF對骨組織的正向調(diào)控，我們設(shè)計了pcDNA3.1(+)-CTGF表達重組質(zhì)粒。

本實驗為了提取豐富的目的基因，我們從CTGF基因表達豐度較高的293T細胞-人腎上皮細胞中提取目的基因，實驗結(jié)果也表明我們成功擴增出了大量的CTGF基因的cDNA，位于～1 000 bp處，與DNA序列數(shù)據(jù)庫(GeneBank)上的參考序列長度相比基本符合。該步驟中用ASK1基因作為陽性對照組，我們之前的研究已經(jīng)證明ASK1基因在該擴增體系中可以成功擴增，以確保擴增體系比例適中。本實驗將CTGF基因在大腸桿菌中大量擴增，然后轉(zhuǎn)染入成骨樣細胞中觀察其表達，所以需要在原核生物和真核細胞中都能發(fā)揮作用的載體。pcDNA3.1(+)載體既攜帶有大腸桿菌的復(fù)制起點，也攜帶有真核啟動子，因此選擇其作為CTGF基因的載體工具[13]。對構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒測序后發(fā)現(xiàn)，兩處腺嘌呤突變?yōu)榘奏ぃ惶幇奏ね蛔優(yōu)轼B嘌呤。進一步比對CTGF基因擴增產(chǎn)物的蛋白序列和參考蛋白序列后發(fā)現(xiàn)，氨基酸并未發(fā)生變化，該突變?yōu)橥x突變。氨基酸由三聯(lián)體密碼子翻譯而來，一個氨基酸可以對應(yīng)多個密碼子，稱為密碼子的簡并性，該特性對生物體減少有害突變具有重要的生物學(xué)意義[14]。最后經(jīng)過細胞轉(zhuǎn)染，檢驗了構(gòu)建的pcDNA 3.1(+)-CTGF重組質(zhì)粒的可靠性。

重組質(zhì)粒是體外研究基因功能的常用手段之一[13,15,16]。基于前期實驗以及文獻調(diào)研，我們設(shè)計和構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-CTGF表達重組質(zhì)粒，并且在成骨樣細胞中可以穩(wěn)定表達，為下一步利用該重組質(zhì)粒研究CTGF基因功能和其在骨折愈合的生物學(xué)機制奠定了基礎(chǔ)。