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        煙草纖維素合成酶1(CESA1)蛋白結構比較

        2019-04-15 01:40:02劉曉柱李銀鳳張學文
        作物研究 2019年4期
        關鍵詞:纖維素煙草克隆

        劉曉柱,李銀鳳,趙 燕,張學文*

        (1 貴州理工學院,貴陽 550000; 2 湖南農(nóng)業(yè)大學,長沙 410128)

        纖維素是一種重要的、與人類生活密切相關的生物大分子,由葡萄糖以β-1,4-糖苷鍵的形式連接而成[1]。自然界中細菌、真菌、植物以及一些低等動物均可合成纖維素[2]。在植物細胞中,纖維素構成了植物初生壁和次生壁[3,4]。通過探討植物纖維素的合成機制,可利用分子生物學技術方式改良植物,提高纖維素的產(chǎn)量[5]。

        目前水稻[6]、擬南芥[7]、馬尾松[8]、苧麻[9]、棉花[10]、楊樹[11]等多種植物的纖維素合成酶基因已被克隆。煙草纖維素是煙草灰分的主要組分,分析煙草纖維素合成酶并與煙草的灰分特性相結合,有利于了解其品質(zhì)形成的機制。煙草SR1 (NicotianatabacumSR1)以及花煙草(Nicotianaalata)的煙草纖維素合成酶1(Cellulose synthase 1,CESA1)基因已被克隆,而煙草WS38 (NicotianatabacumWS38)品種的CESA1基因的克隆尚未見報道。此外,不同的煙草品種間CESA1蛋白結構差異性的報道少見。因此,本研究通過RT-PCR方法克隆了煙草WS38CESA1基因,并利用生物信息學方法比較了3個煙草品種間CESA1蛋白的結構特征,以期為煙草分子遺傳育種提供一定的理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 植物材料

        煙草品種WS38,由湖南農(nóng)業(yè)大學細胞生物學實驗室提供,用恒溫植物溫室培育而成,培養(yǎng)條件為:22℃、15 h/9 h(光照/黑暗)。

        1.2 煙草WS38 CESA1基因的克隆

        以培養(yǎng)4周的煙草WS38葉片為材料,使用總RNA試劑盒 (B618583,Sangon Biotech) 提取總RNA,其步驟和方法按照試劑盒說明書進行。提取的煙草總RNA質(zhì)量和濃度分別利用甲醛變形膠凝膠電泳和核酸蛋白儀進行檢測分析。

        采用RT-PCR方法克隆了煙草WS38CESA1基因。首先使用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒 (B532435,Sangon Biotech)和煙草WS38總RNA,反轉(zhuǎn)錄生成cDNA,其步驟和方法按照試劑盒說明書進行。參考花煙草 (Nicotianaalata)CESA1基因的核苷酸序列(AF304374.1) 設計煙草WS38CESA1基因克隆引物NtCESA1-F和NtCESA1-R (表1),以煙草WS38的cDNA為模板進行PCR擴增;擴增條件為:95℃、4 min,94℃、30 s,55℃、1 min,72℃、4 min(共循環(huán)40回)。

        使用柱式純化試劑盒 (B518141,Sangon Biotech) 純化PCR產(chǎn)物,其步驟和方法按照試劑盒說明書進行。PCR純化產(chǎn)物16℃過夜連接至pMD18-T載體上,陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR和雙酶切檢測后,送上海生工生物科技有限公司進行測序檢驗。

        表1 WS38 CESA1基因克隆引物

        1.3 煙草CESA1基因序列分析

        利用軟件DNAStar進行煙草WS38CESA1基因開放閱讀框的查找和翻譯。利用在線網(wǎng)站BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 對煙草WS38CESA1基因序列進行比對分析。從NCBI網(wǎng)站上下載煙草SR1CESA1基因(JQ686940.1)編碼區(qū)mRNA序列和蛋白質(zhì)序列(AFY06685.1),花煙草CESA1基因核苷酸序列 (AF304374.1) 和蛋白質(zhì)序列 (AAK49454.1)。采用DNAMAN對煙草CESA1蛋白序列進行多重線性比對。

        1.4 煙草CESA1蛋白結構特征分析

        利用在線分析工具SMART和TMHMM預測了煙草CESA1蛋白結構特征。使用MEAG X軟件構建植物CESA1蛋白系統(tǒng)進化樹。

        2 結果與分析

        2.1 煙草WS38 CESA1基因的克隆

        提取煙草WS38葉片總RNA,檢測其濃度為0.74 μg/μL,OD260nm/OD280nm為1.95。凝膠電泳顯示,煙草WS38總RNA的28S、18S以及5S條帶較為整齊明顯(圖1)。提取的煙草總RNA質(zhì)量較好,并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

        圖1 煙草WS38總RNA凝膠電泳Fig.1 Gel electrophoresis analysis of total RNA from Nicotiana tabacum WS38

        以煙草WS38葉片cDNA為模板,以NtCESA1-F和NtCESA1-R為引物,擴增到1條約3 kb特異性目標條帶(圖2)?;厥誔CR產(chǎn)物,連接至pMD18-T載體上,經(jīng)菌落PCR和雙酶切驗證后,測序檢驗。

        注:M:1kb DNA marker;1:煙草WS38 PCR擴增條帶。圖2 煙草WS38 CESA1基因的PCR擴增凝膠電泳Fig.2 Gel electrophoresis analysis of CESA1 gene from Nicotiana tabacum WS38

        測序分析表明,克隆的PCR產(chǎn)物全長3276 bp,編碼1091個氨基酸。BLAST序列比對發(fā)現(xiàn),克隆獲得的序列與煙草SR1以及花煙草CESA1序列的同源性超過98%。因此,煙草WS38CESA1基因編碼區(qū)序列被成功克隆,命名為NtCESA1,并提交至Gen Bank (登錄號:JN009108.1)。

        2.2 煙草CESA1蛋白序列分析

        比較煙草WS38、SR1以及花煙草的CESA1蛋白序列發(fā)現(xiàn),三者CESA1蛋白氨基酸個數(shù)均為1090個,三者有差異的氨基酸個數(shù)為15 (圖3)。其中在WS38和SR1之間有9個氨基酸相同、但與花煙草的不同,其中7個不同的氨基酸分布在CESA1的N端。煙草SR1與花煙草有6個氨基酸相同、但與WS38不同,其中4個不同的氨基酸分布在CESA1的C端。

        圖3 煙草CESA1蛋白序列比對Fig.3 Protein sequence alignment of Nicotiana CESA1

        煙草CESA1氨基酸組成分析顯示,煙草SR1和花煙草堿性氨基酸個數(shù)相同,為129個,比煙草WS38多1個;煙草WS38和煙草SR1酸性氨基酸(D,E)個數(shù)相同,為127個,比花煙草少1個。

        蛋白分子量與等電點分析顯示,煙草WS38 CESA1蛋白理論分子量大小為122.54 kDa,理論等電點為7.46;煙草SR1 CESA1蛋白理論分子量大小為122.76 kDa,理論等電點為7.65;花煙草CESA理論分子量大小為122.68 kDa,理論等電點為7.45。分析結果表明,3個煙草品種CESA1蛋白的分子量與等電點均比較接近,煙草SR1 CESA1的分子量與等電點最大。

        蛋白親疏水特性分析結果表明(圖4),煙草WS38、SR1以及花煙草的CESA1蛋白最大親水位點均為第1057位,氨基酸為色氨酸(W),分值為3.089;最小疏水位點均為第230位,氨基酸為賴氨酸(K),分值為-3.389。三者CESA1蛋白的親疏水特性相同。

        圖4 煙草CESA1蛋白親水性預測結果Fig.4 Prediction of Nicotiana CESA1 hydrophilcity

        2.3 煙草CESA1蛋白結構分析

        CESA1蛋白結構特征在線分析結果顯示,煙草WS38、SR1以及花煙草CESA1的39至84位點預測到1個鋅指結構 (ZF Ring),同時CESA1中還包含了8個跨膜結構域 (transmembrane region) 以及多個低靈活性位點 (low complexity) (圖5)。但某些結構的起始位點在不同的煙草品種中具有差異 (表2)。如煙草WS38和SR1的241至250位點為低復雜度,而花煙草位點為241至257;在花煙草的665至675位點存在1個低復雜度,但煙草WS38和SR1中沒有。煙草WS38和花煙草的680至697位點存在著1個低復雜度,在煙草SR1中位點則為680至698。此外,煙草SR1和花煙草的939至961位點存在一個跨膜結構域,該結構域在煙草WS38中的位點為939至968。

        圖5 煙草CESA1蛋白結構特征預測結果Fig.5 Prediction of Nicotiana CESA1 structure characteristics

        表2 煙草CESA1蛋白特征位點分析結果

        續(xù)表2

        位點煙草WS38煙草SR1花煙草(Nicotianaalata)起點終點起點終點起點終點跨膜區(qū)868890868890868890跨膜區(qū)902924902924902924跨膜區(qū)939968939961939961跨膜區(qū)986100898610089861008跨膜區(qū)101810401018104010181040跨膜區(qū)105310721053107210531072

        利用TMHMM在線工具進一步分析煙草CESA1跨膜結構特性,TMHMM預測結果與SMART分析結果一致,3個品種煙草CESA1中均包含8個跨膜結構域 (圖6)。

        圖6 煙草CESA1蛋白跨膜結構域預測Fig.6 Prediction of Nicotiana CESA1 transmembrane domains

        蛋白功能的發(fā)揮與其結構緊密相關,利用在線工具對3個煙草品種CESA1蛋白的高級結構進行了預測分析。結果表明,3個煙草品種CESA1蛋白二級結構中均包含了無規(guī)則卷曲(Random coil)、α-螺旋(Alpha helix)和鏈延伸(Extended strand) (圖7)。在煙草WS38 CESA1蛋白二級結構中,超過一半的二級結構是無規(guī)則卷曲(681個),比例和個數(shù)是3個品種中最多的。煙草SR1的CESA1蛋白二級結構中無規(guī)則卷曲個數(shù)和比例最少(668個,61.23%),而其α-螺旋和鏈延伸個數(shù)最多,分別為304個和為119個(表3)。

        圖7 煙草CESA1蛋白二級結構Fig.7 Prediction of Nicotiana CESA1 secondary structures

        表3 煙草CESA1蛋白二級結構分析

        煙草CEAS1蛋白三級結構的預測結果發(fā)現(xiàn)(圖8),3個煙草品種的CEAS1蛋白均包含無規(guī)則卷曲、α-螺旋和鏈延伸,與其二級結構較為吻合。此外,煙草WS38 和SR1的三級結構比較接近,與花煙草的差別較大。

        圖8 煙草CESA1蛋白三級結構Fig.8 Prediction of Nicotiana CESA1 tertiary structures

        此外,蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮還依賴于特定位點的磷酸化修飾。因此,對3個煙草品種CESA1蛋白的磷酸化修飾進行了預測。結果表明,3個煙草品種的CESA1蛋白中都包括有絲氨酸(Serine)位點、蘇氨酸(Threonine)位點以及酪氨酸(Tyrosine)位點的磷酸化修飾,具有磷酸激酶的活性 (圖9)。另外,3個煙草品種CESA1磷酸化修飾位點個數(shù)和位置均相同,沒有差異。

        圖9 煙草CESA1蛋白磷酸化位點預測Fig.9 Prediction of Nicotiana CESA1 phosphorylation sites

        蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮,還與其在細胞中的定位有關,因此預測了煙草CEAS1在細胞中的定位。亞細胞定位預測結果顯示,3個煙草CESA1均定位在細胞質(zhì)膜上(圖10)。

        2.4 煙草CESA1蛋白進化關系分析

        使用MEAG X軟件構建了部分植物CESA1蛋白的系統(tǒng)進化樹(圖11)。結果發(fā)現(xiàn),3個煙草CESA1親緣關系最近,構建到進化樹的1枝上,這一結果與CESA1蛋白結構分析預測結果比較一致。此外,煙草CESA1與團花樹(Neolamarckiacadamba)CESA1(AFP93559.1) 親緣關系最近,而與馬占相思(Acaciamangium)CESA1 (AAT66940.1) 親緣關系最遠。

        圖10 煙草CESA1蛋白亞細胞定位預測Fig.10 Prediction of Nicotiana CESA1 subcellular location

        圖11 煙草CESA1蛋白系統(tǒng)進化分析Fig.11 Evolution analysis of Nicotiana CESA1

        3 討論

        植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素、果膠等成分組成,植物纖維素的合成是一個復雜的生理過程,由纖維素合成酶家族參與合成[12,13]。植物纖維素合成酶家族由多個成員構成,如雙子葉植物擬南芥中有12個,單子葉植物水稻和玉米中也超過10個[14]。煙草CESA1參與調(diào)控煙草纖維的發(fā)育、細胞的伸長等多種生長發(fā)育過程。鑒于此,本研究克隆了煙草品種WS38CESA1基因,進而通過生物信息學方法比較了煙草品種間CESA1的結構差異。結果發(fā)現(xiàn),3個煙草品種間,CESA1在一級結構、二級結構以及三級結構比較相似,但也具有一定的差異,煙草WS38和SR1之間的差異性較小,與花煙草(Nicotianaalata)之間的差異較大,蛋白系統(tǒng)進化分析顯示煙草WS38與SR1親緣關系較近;3個煙草品種CESA1典型的結構特征均相同,如N端都具有1個鋅指結構,均具有8個跨膜結構域,磷酸化位點修飾均相同,具有蛋白激酶活性。此外,3個煙草品種CESA1均定位在細胞膜上,因此3個CESA1功能應較為一致,均可發(fā)揮纖維素催化合成的功能。

        相比較于傳統(tǒng)植物育種手段而言,分子生物學技術以及植物基因工程的發(fā)展,為植物的遺傳改良提供了新的、快速的方法。對于一些纖維經(jīng)濟植物,如棉花、苧麻、亞麻等,通過明確其纖維素合成酶1的功能以及纖維素合成機理,借助基因工程手段進行育種,提高纖維素的產(chǎn)量和含量。煙草是植物研究中的一種模式物種,本研究通過對3個煙草品種CESA1蛋白結構的分析,進一步明確了品種間CESA1蛋白結構特征,為其它物種的研究提供一定的參考。同時,煙草纖維素是煙草灰分的主要組分,分析煙草纖維素合成酶并與煙草的灰分特性相結合,有利于了解其品質(zhì)形成的機制。

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