劉曉柱，李銀鳳，趙 燕，張學(xué)文*

(1 貴州理工學(xué)院，貴陽 550000； 2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙 410128)

纖維素是一種重要的、與人類生活密切相關(guān)的生物大分子，由葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵的形式連接而成[1]。自然界中細(xì)菌、真菌、植物以及一些低等動物均可合成纖維素[2]。在植物細(xì)胞中，纖維素構(gòu)成了植物初生壁和次生壁[3，4]。通過探討植物纖維素的合成機制，可利用分子生物學(xué)技術(shù)方式改良植物，提高纖維素的產(chǎn)量[5]。

目前水稻[6]、擬南芥[7]、馬尾松[8]、苧麻[9]、棉花[10]、楊樹[11]等多種植物的纖維素合成酶基因已被克隆。煙草纖維素是煙草灰分的主要組分，分析煙草纖維素合成酶并與煙草的灰分特性相結(jié)合，有利于了解其品質(zhì)形成的機制。煙草SR1 (NicotianatabacumSR1)以及花煙草(Nicotianaalata)的煙草纖維素合成酶1(Cellulose synthase 1，CESA1)基因已被克隆，而煙草WS38 (NicotianatabacumWS38)品種的CESA1基因的克隆尚未見報道。此外，不同的煙草品種間CESA1蛋白結(jié)構(gòu)差異性的報道少見。因此，本研究通過RT-PCR方法克隆了煙草WS38CESA1基因，并利用生物信息學(xué)方法比較了3個煙草品種間CESA1蛋白的結(jié)構(gòu)特征，以期為煙草分子遺傳育種提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

煙草品種WS38，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實驗室提供，用恒溫植物溫室培育而成，培養(yǎng)條件為：22℃、15 h/9 h(光照/黑暗)。

1.2 煙草WS38 CESA1基因的克隆

以培養(yǎng)4周的煙草WS38葉片為材料，使用總RNA試劑盒 (B618583，Sangon Biotech) 提取總RNA，其步驟和方法按照試劑盒說明書進行。提取的煙草總RNA質(zhì)量和濃度分別利用甲醛變形膠凝膠電泳和核酸蛋白儀進行檢測分析。

采用RT-PCR方法克隆了煙草WS38CESA1基因。首先使用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒 (B532435，Sangon Biotech)和煙草WS38總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，其步驟和方法按照試劑盒說明書進行。參考花煙草 (Nicotianaalata)CESA1基因的核苷酸序列(AF304374.1) 設(shè)計煙草WS38CESA1基因克隆引物NtCESA1-F和NtCESA1-R (表1)，以煙草WS38的cDNA為模板進行PCR擴增；擴增條件為：95℃、4 min，94℃、30 s，55℃、1 min，72℃、4 min(共循環(huán)40回)。

使用柱式純化試劑盒 (B518141，Sangon Biotech) 純化PCR產(chǎn)物，其步驟和方法按照試劑盒說明書進行。PCR純化產(chǎn)物16℃過夜連接至pMD18-T載體上，陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR和雙酶切檢測后，送上海生工生物科技有限公司進行測序檢驗。

表1 WS38 CESA1基因克隆引物

1.3 煙草CESA1基因序列分析

利用軟件DNAStar進行煙草WS38CESA1基因開放閱讀框的查找和翻譯。利用在線網(wǎng)站BLAST (https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 對煙草WS38CESA1基因序列進行比對分析。從NCBI網(wǎng)站上下載煙草SR1CESA1基因(JQ686940.1)編碼區(qū)mRNA序列和蛋白質(zhì)序列(AFY06685.1)，花煙草CESA1基因核苷酸序列 (AF304374.1) 和蛋白質(zhì)序列 (AAK49454.1)。采用DNAMAN對煙草CESA1蛋白序列進行多重線性比對。

1.4 煙草CESA1蛋白結(jié)構(gòu)特征分析

利用在線分析工具SMART和TMHMM預(yù)測了煙草CESA1蛋白結(jié)構(gòu)特征。使用MEAG X軟件構(gòu)建植物CESA1蛋白系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草WS38 CESA1基因的克隆

提取煙草WS38葉片總RNA，檢測其濃度為0.74 μg/μL，OD260nm/OD280nm為1.95。凝膠電泳顯示，煙草WS38總RNA的28S、18S以及5S條帶較為整齊明顯(圖1)。提取的煙草總RNA質(zhì)量較好，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

圖1 煙草WS38總RNA凝膠電泳Fig.1 Gel electrophoresis analysis of total RNA from Nicotiana tabacum WS38

以煙草WS38葉片cDNA為模板，以NtCESA1-F和NtCESA1-R為引物，擴增到1條約3 kb特異性目標(biāo)條帶(圖2)。回收PCR產(chǎn)物，連接至pMD18-T載體上，經(jīng)菌落PCR和雙酶切驗證后，測序檢驗。

注：M：1kb DNA marker；1：煙草WS38 PCR擴增條帶。圖2 煙草WS38 CESA1基因的PCR擴增凝膠電泳Fig.2 Gel electrophoresis analysis of CESA1 gene from Nicotiana tabacum WS38

測序分析表明，克隆的PCR產(chǎn)物全長3276 bp，編碼1091個氨基酸。BLAST序列比對發(fā)現(xiàn)，克隆獲得的序列與煙草SR1以及花煙草CESA1序列的同源性超過98%。因此，煙草WS38CESA1基因編碼區(qū)序列被成功克隆，命名為NtCESA1，并提交至Gen Bank (登錄號：JN009108.1)。

2.2 煙草CESA1蛋白序列分析

比較煙草WS38、SR1以及花煙草的CESA1蛋白序列發(fā)現(xiàn)，三者CESA1蛋白氨基酸個數(shù)均為1090個，三者有差異的氨基酸個數(shù)為15 (圖3)。其中在WS38和SR1之間有9個氨基酸相同、但與花煙草的不同，其中7個不同的氨基酸分布在CESA1的N端。煙草SR1與花煙草有6個氨基酸相同、但與WS38不同，其中4個不同的氨基酸分布在CESA1的C端。

圖3 煙草CESA1蛋白序列比對Fig.3 Protein sequence alignment of Nicotiana CESA1

煙草CESA1氨基酸組成分析顯示，煙草SR1和花煙草堿性氨基酸個數(shù)相同，為129個，比煙草WS38多1個；煙草WS38和煙草SR1酸性氨基酸(D，E)個數(shù)相同，為127個，比花煙草少1個。

蛋白分子量與等電點分析顯示，煙草WS38 CESA1蛋白理論分子量大小為122.54 kDa，理論等電點為7.46；煙草SR1 CESA1蛋白理論分子量大小為122.76 kDa，理論等電點為7.65；花煙草CESA理論分子量大小為122.68 kDa，理論等電點為7.45。分析結(jié)果表明，3個煙草品種CESA1蛋白的分子量與等電點均比較接近，煙草SR1 CESA1的分子量與等電點最大。

蛋白親疏水特性分析結(jié)果表明(圖4)，煙草WS38、SR1以及花煙草的CESA1蛋白最大親水位點均為第1057位，氨基酸為色氨酸(W)，分值為3.089；最小疏水位點均為第230位，氨基酸為賴氨酸(K)，分值為-3.389。三者CESA1蛋白的親疏水特性相同。

圖4 煙草CESA1蛋白親水性預(yù)測結(jié)果Fig.4 Prediction of Nicotiana CESA1 hydrophilcity

2.3 煙草CESA1蛋白結(jié)構(gòu)分析

CESA1蛋白結(jié)構(gòu)特征在線分析結(jié)果顯示，煙草WS38、SR1以及花煙草CESA1的39至84位點預(yù)測到1個鋅指結(jié)構(gòu) (ZF Ring)，同時CESA1中還包含了8個跨膜結(jié)構(gòu)域 (transmembrane region) 以及多個低靈活性位點 (low complexity) (圖5)。但某些結(jié)構(gòu)的起始位點在不同的煙草品種中具有差異 (表2)。如煙草WS38和SR1的241至250位點為低復(fù)雜度，而花煙草位點為241至257；在花煙草的665至675位點存在1個低復(fù)雜度，但煙草WS38和SR1中沒有。煙草WS38和花煙草的680至697位點存在著1個低復(fù)雜度，在煙草SR1中位點則為680至698。此外，煙草SR1和花煙草的939至961位點存在一個跨膜結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在煙草WS38中的位點為939至968。

圖5 煙草CESA1蛋白結(jié)構(gòu)特征預(yù)測結(jié)果Fig.5 Prediction of Nicotiana CESA1 structure characteristics

表2 煙草CESA1蛋白特征位點分析結(jié)果

續(xù)表2

位點煙草WS38煙草SR1花煙草(Nicotianaalata)起點終點起點終點起點終點跨膜區(qū)868890868890868890跨膜區(qū)902924902924902924跨膜區(qū)939968939961939961跨膜區(qū)986100898610089861008跨膜區(qū)101810401018104010181040跨膜區(qū)105310721053107210531072

利用TMHMM在線工具進一步分析煙草CESA1跨膜結(jié)構(gòu)特性，TMHMM預(yù)測結(jié)果與SMART分析結(jié)果一致，3個品種煙草CESA1中均包含8個跨膜結(jié)構(gòu)域 (圖6)。

圖6 煙草CESA1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.6 Prediction of Nicotiana CESA1 transmembrane domains

蛋白功能的發(fā)揮與其結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，利用在線工具對3個煙草品種CESA1蛋白的高級結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測分析。結(jié)果表明，3個煙草品種CESA1蛋白二級結(jié)構(gòu)中均包含了無規(guī)則卷曲(Random coil)、α-螺旋(Alpha helix)和鏈延伸(Extended strand) (圖7)。在煙草WS38 CESA1蛋白二級結(jié)構(gòu)中，超過一半的二級結(jié)構(gòu)是無規(guī)則卷曲(681個)，比例和個數(shù)是3個品種中最多的。煙草SR1的CESA1蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲個數(shù)和比例最少(668個，61.23%)，而其α-螺旋和鏈延伸個數(shù)最多，分別為304個和為119個(表3)。

圖7 煙草CESA1蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.7 Prediction of Nicotiana CESA1 secondary structures

表3 煙草CESA1蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

煙草CEAS1蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖8)，3個煙草品種的CEAS1蛋白均包含無規(guī)則卷曲、α-螺旋和鏈延伸，與其二級結(jié)構(gòu)較為吻合。此外，煙草WS38 和SR1的三級結(jié)構(gòu)比較接近，與花煙草的差別較大。

圖8 煙草CESA1蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.8 Prediction of Nicotiana CESA1 tertiary structures

此外，蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮還依賴于特定位點的磷酸化修飾。因此，對3個煙草品種CESA1蛋白的磷酸化修飾進行了預(yù)測。結(jié)果表明，3個煙草品種的CESA1蛋白中都包括有絲氨酸(Serine)位點、蘇氨酸(Threonine)位點以及酪氨酸(Tyrosine)位點的磷酸化修飾，具有磷酸激酶的活性 (圖9)。另外，3個煙草品種CESA1磷酸化修飾位點個數(shù)和位置均相同，沒有差異。

圖9 煙草CESA1蛋白磷酸化位點預(yù)測Fig.9 Prediction of Nicotiana CESA1 phosphorylation sites

蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮，還與其在細(xì)胞中的定位有關(guān)，因此預(yù)測了煙草CEAS1在細(xì)胞中的定位。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，3個煙草CESA1均定位在細(xì)胞質(zhì)膜上(圖10)。

2.4 煙草CESA1蛋白進化關(guān)系分析

使用MEAG X軟件構(gòu)建了部分植物CESA1蛋白的系統(tǒng)進化樹(圖11)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個煙草CESA1親緣關(guān)系最近，構(gòu)建到進化樹的1枝上，這一結(jié)果與CESA1蛋白結(jié)構(gòu)分析預(yù)測結(jié)果比較一致。此外，煙草CESA1與團花樹(Neolamarckiacadamba)CESA1(AFP93559.1) 親緣關(guān)系最近，而與馬占相思(Acaciamangium)CESA1 (AAT66940.1) 親緣關(guān)系最遠。

圖10 煙草CESA1蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測Fig.10 Prediction of Nicotiana CESA1 subcellular location

圖11 煙草CESA1蛋白系統(tǒng)進化分析Fig.11 Evolution analysis of Nicotiana CESA1

3 討論

植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素、果膠等成分組成，植物纖維素的合成是一個復(fù)雜的生理過程，由纖維素合成酶家族參與合成[12，13]。植物纖維素合成酶家族由多個成員構(gòu)成，如雙子葉植物擬南芥中有12個，單子葉植物水稻和玉米中也超過10個[14]。煙草CESA1參與調(diào)控?zé)煵堇w維的發(fā)育、細(xì)胞的伸長等多種生長發(fā)育過程。鑒于此，本研究克隆了煙草品種WS38CESA1基因，進而通過生物信息學(xué)方法比較了煙草品種間CESA1的結(jié)構(gòu)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個煙草品種間，CESA1在一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)構(gòu)比較相似，但也具有一定的差異，煙草WS38和SR1之間的差異性較小，與花煙草(Nicotianaalata)之間的差異較大，蛋白系統(tǒng)進化分析顯示煙草WS38與SR1親緣關(guān)系較近；3個煙草品種CESA1典型的結(jié)構(gòu)特征均相同，如N端都具有1個鋅指結(jié)構(gòu)，均具有8個跨膜結(jié)構(gòu)域，磷酸化位點修飾均相同，具有蛋白激酶活性。此外，3個煙草品種CESA1均定位在細(xì)胞膜上，因此3個CESA1功能應(yīng)較為一致，均可發(fā)揮纖維素催化合成的功能。

相比較于傳統(tǒng)植物育種手段而言，分子生物學(xué)技術(shù)以及植物基因工程的發(fā)展，為植物的遺傳改良提供了新的、快速的方法。對于一些纖維經(jīng)濟植物，如棉花、苧麻、亞麻等，通過明確其纖維素合成酶1的功能以及纖維素合成機理，借助基因工程手段進行育種，提高纖維素的產(chǎn)量和含量。煙草是植物研究中的一種模式物種，本研究通過對3個煙草品種CESA1蛋白結(jié)構(gòu)的分析，進一步明確了品種間CESA1蛋白結(jié)構(gòu)特征，為其它物種的研究提供一定的參考。同時，煙草纖維素是煙草灰分的主要組分，分析煙草纖維素合成酶并與煙草的灰分特性相結(jié)合，有利于了解其品質(zhì)形成的機制。