勾智麗

(扎蘭屯職業(yè)學(xué)院林業(yè)工程系，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 162650)

篤斯越桔花色苷的提取方法主要包括溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等。溶劑提取法是應(yīng)用最廣泛的方法，在破壞植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的同時(shí)使花色苷溶出。微波和超聲波輔助提取法都是在溶劑提取法的基礎(chǔ)上輔以微波和超聲波的作用來提高提取效率[1]。這3種方法，所用的提取溶劑組成和配比種類很多，但是這些溶劑體系對(duì)越桔果實(shí)花色苷的提取效率未曾進(jìn)行過系統(tǒng)的分析比較。為了更客觀地評(píng)價(jià)越桔果實(shí)中花色苷的含量和抗氧化活性，研究將致力于分析比較花色苷提取中的幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：破碎方式、溶劑體系和提取方式的選擇，然后對(duì)篤斯越桔花色苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 花色苷提取工藝原料 選用水濕地土型生境類型采摘的野生篤斯越桔果實(shí)作為原料，采集地點(diǎn)位于大興安嶺北部林區(qū)，地理坐標(biāo)為124°25′ E，51°43′ N，海拔為512 m。在相同的立地條件下隨機(jī)抽取30株植株，每株采集3個(gè)結(jié)果穗，將采集的果實(shí)混合。

1.1.2 標(biāo)樣 二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷，試劑：甲醇、乙醇、鹽酸、乙酸均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 使用儀器 SHA-CA型水浴振蕩器、JJ-2型組織搗碎機(jī)、UV-2800A型紫外分光光度計(jì)、DT5-2B型離心機(jī)、SL-N系列電子天平、QL-90型漩渦混合器、RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵、LGJ-19S型冷凍干燥機(jī)、JY99-IIDN型超聲波儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花色苷含量的測(cè)定方法 采用示差法[2]，并略加改進(jìn)?；ㄉ仗崛∫悍謩e與0.025 mol·L-1的NaCl緩沖液(pH=1)和0.4 mol·L-1的CH3COONa緩沖液(pH=4.5)以1/8(V/V)的比例混合，與NaCl緩沖液混合的樣品利用分光光度計(jì)在400～750 nm的波長范圍內(nèi)掃描，用以確定其最大吸收波長λvis-max，每個(gè)花色苷提取樣品均在λvis-max和700 nm的波長下讀取吸光值。所有樣品在配制15 min后測(cè)定，并在1 h內(nèi)完成。將吸光值換算為花色苷含量(TAC)，表示為每100 g鮮果中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷(MGE)的含量(mg)。計(jì)算公式如下：

TAC=A×MW×DF×V×105/(ε×L×M)

A= (Avis-max-A700)pH1.0-(Avis-max-A700)pH4.5

式中：A—吸光值；MW—二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量493 mol·g-1；ε—二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的摩爾吸光系數(shù)21200；L—液層厚度1 cm；M—原料鮮果質(zhì)量g。

1.2.2 果實(shí)破碎方式的確定 分別利用勻漿法和液氮研磨法對(duì)越桔果實(shí)進(jìn)行破碎，比較分析兩種方法處理后果實(shí)花色苷提取效率。

勻漿法：將一定量的越桔果實(shí)放入組織搗碎機(jī)中，以物料沒過攪拌旋葉為準(zhǔn)，勻漿10 min，取出勻漿的原料并混合均勻，從中稱取1 g放入50 mL三角瓶中，再加入10 mL不同的溶劑體系，放在水浴振蕩器內(nèi)以250 rpm室溫下避光提取1 h，離心取上清液，測(cè)定花色苷含量。每次實(shí)驗(yàn)均采用3個(gè)平行樣品。

液氮研磨法：液氮磨制樣品是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的方法，如果將其應(yīng)用于活性成分的提取，不但可以消除高溫和氧氣的不利影響，還可以保證良好的均細(xì)度[3]。將一定量的越桔果實(shí)放入研缽，并在液氮中研磨，稱取1 g放入50 mL三角瓶中，再加入10 mL不同的溶劑體系，放入水浴振蕩器內(nèi)以250 rpm室溫下避光提取1 h，離心取上清液，測(cè)定花色苷含量。每次實(shí)驗(yàn)均采用三個(gè)平行樣品。

1.2.3 溶劑體系的確定 針對(duì)甲醇和乙醇系列溶劑提取花色苷的效率進(jìn)行比較分析，包括甲醇(M)系列：M1-甲醇/水(65∶35，V/V)、M2-甲醇/水(80∶20，V/V)、M3-甲醇/水/乙酸(80∶19∶1，V/V)、M4-甲醇/水/鹽酸(80∶19∶1，V/V)；乙醇(E)系列：E1-乙醇/水(65∶35，V/V)、E2-乙醇/水(80∶20，V/V)、E3-乙醇/水/乙酸(80∶19∶1，V/V)、E4-乙醇/水/鹽酸(80∶19∶1，V/V)。精確稱取1 g以不同方式破碎的果實(shí)樣品，加入含有10 mL溶劑的50 mL三角瓶中，放在水浴振蕩器內(nèi)以250 rpm室溫下避光提取1h，離心取上清液，分別測(cè)定花色苷含量。每次實(shí)驗(yàn)均采用三個(gè)平行樣品。

1.2.4 提取方式和提取次數(shù)的確定 精確稱取1 g果實(shí)樣品(按選定方法破碎)，加入10 mL選定的溶劑體系，分別利用溶劑浸提法和超聲輔助提取法提取花色苷。溶劑浸提法：放入水浴振蕩器(250 rpm)內(nèi)室溫下避光提取1 h；超聲輔助提取法：放入超聲波儀內(nèi)避光提取20 min，離心取上清液。殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄔ偬崛?次，分別測(cè)定花色苷含量。每次實(shí)驗(yàn)均采用三個(gè)平行樣品。

1.2.5 篤斯越桔花色苷提取工藝參數(shù)優(yōu)化 確定最佳的破碎方法、溶劑體系和提取方式后，對(duì)料液比、提取時(shí)間、功率等進(jìn)行單因素試驗(yàn)，最后通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最佳提取工藝參數(shù)。單因素和正交試驗(yàn)中每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3次。每次實(shí)驗(yàn)均采用三個(gè)平行樣品。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以三個(gè)平行樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示，利用Microsoft Excel 2007和SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。方差分析利用Student Newman Keuls法，置信區(qū)間為95%，圖表中表示的不同英文小寫字母表示同一項(xiàng)目的數(shù)據(jù)結(jié)果存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 破碎方式和溶劑體系對(duì)篤斯越桔花色苷提取效率的影響

不同破碎方式和溶劑體系提取所得的花色苷含量如圖1所示。無論用哪種溶劑體系進(jìn)行花色苷的提取，篤斯越桔鮮果經(jīng)液氮研磨后所得的提取液中花色苷含量明顯高于經(jīng)勻漿破碎的樣品。與傳統(tǒng)的勻漿破碎方法相比，液氮研磨破碎平均可從鮮果中多提取花色苷36.59 mg·(100 g)-1，即增加了10%的提取率。主要原因一是液氮磨樣能保證良好的粒度均一性，且顆粒較細(xì)，二是花色苷對(duì)溫度敏感，機(jī)械破碎會(huì)產(chǎn)生的熱能使樣品溫度升高，導(dǎo)致花色苷部分降解，液氮研磨保證了樣品在低溫環(huán)境下破碎，可有效防止花色苷降解，并能保持其生物活性。Xu等指出液氮破碎處理可顯著提高葡萄果實(shí)中酚類物質(zhì)的提取率[4]，對(duì)于藍(lán)莓鮮果，本研究也得到了相同的結(jié)果，由此說明在實(shí)驗(yàn)室條件下液氮研磨預(yù)處理可顯著提高原料中生物活性物質(zhì)的提取效率。

提取花色苷的溶劑經(jīng)常為酸化甲醇或乙醇的水溶液。根據(jù)相似相溶原理，甲醇或乙醇與水混合的溶劑系統(tǒng)大于純的有機(jī)溶劑，當(dāng)溶劑的極性增大到與花色苷極性相近時(shí)，可以溶解出更多的花色苷。而花色苷在酸性環(huán)境中更穩(wěn)定，所以一般在溶劑體系中加入弱酸或強(qiáng)酸來降低pH值。在本試驗(yàn)中，甲醇溶劑系統(tǒng)和乙醇溶劑系統(tǒng)對(duì)于花色苷的提取率并無顯著差異，M4-甲醇/水/鹽酸(80∶19∶1，V/V)和E4-乙醇/水/鹽酸(80∶19∶1，V/V)的提取率最高，液氮研磨后樣品提取液中花色苷含量分別為478.75和480.42 mg·(100 g)-1，而M1-M3和E1-E3溶劑系列的花色苷提取率不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。這說明乙酸在提高花色苷提取效率上作用不明顯，而鹽酸卻起著重要作用，主要原因?yàn)榈葷舛塞}酸使溶劑體系的pH值變得更低，有效地保護(hù)了花色苷免受氧化和降解，從而提高了提取效率。由于提取得到的花色苷一般作為保健食品等的添加成分，考慮到安全性問題，我們?cè)谝韵聦?shí)驗(yàn)中均采用E4乙醇溶劑體系。

2.2 提取方式和提取次數(shù)對(duì)篤斯越桔花色苷提取效率的影響。

提取方式和提取次數(shù)對(duì)花色苷提取效率的影響如圖2所示，總體來看，連續(xù)20 min超聲波輔助提取比連續(xù)1 h溶劑浸提(加以機(jī)械震蕩)的花色苷提取效率高，相同體積提取液花色苷的含量平均增加了26.72 mg·(100 g)-1。對(duì)于這兩種提取方法，第一次提取產(chǎn)量分別占總提取產(chǎn)量的91%和92%，重復(fù)提取三次均可達(dá)到最高產(chǎn)量，分別為513.54和539.56 mg·(100 g)-1，證明三次連續(xù)提取基本可將花色苷全部提取出來。超聲波主要利用其強(qiáng)大的空化相應(yīng)、強(qiáng)烈的震蕩、較高的加速度等破壞植物原料的細(xì)胞壁，促使細(xì)胞中的內(nèi)容物溶出，提高提取效率。但超聲輔助提取特別需要注意的是，長時(shí)間超聲作用產(chǎn)生的熱能可能使水浴溫度高于60 ℃，這會(huì)造成花色苷化合物的降解[5]，為了避免這一現(xiàn)象，在超聲波儀內(nèi)的水槽中加入了一定量的冰塊，使水浴溫度一直保持在較低水平，來避免花色苷的降解。

圖1 不同破碎方式和溶劑體系對(duì)篤斯越桔花色苷提取效率的影響

圖2 不同提取方式和提取次數(shù)對(duì)篤斯越桔花色苷提取率的影響

2.3 超聲輔助提取篤斯越桔花色苷工藝優(yōu)化

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇/水/鹽酸(80∶19∶1，V/V)的溶劑體系進(jìn)行超聲輔助提取篤斯越桔果實(shí)花色苷的單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)都重復(fù)提取3次。

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

圖3 超聲輔助提取篤斯越桔花色苷的單因素實(shí)驗(yàn)(a.料液比；b.超聲功率；c.提取時(shí)間)

對(duì)于相同的原料質(zhì)量，溶劑體積越大，花色苷的提取效率越高，主要原因是溶劑體積的增加能提高分子擴(kuò)散速率并縮短平衡時(shí)間。花色苷的提取效率從1∶5料液比的366.97 mg·(100 g)-1升高到1∶30料液比的478.54 mg·(100 g)-1(圖a)。但從統(tǒng)計(jì)學(xué)上看，1∶20的料液比已經(jīng)使篤斯越桔果實(shí)花色苷的提取效率達(dá)到了最高，再增加溶劑的體積(1∶25和1∶30)也沒有使花色苷的提取效率顯著提高。

超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈震動(dòng)和空化效應(yīng)能夠使植物細(xì)胞內(nèi)的花色苷分子快速溶解于溶劑中，提高提取效率。隨著超聲功率的升高，花色苷的提取效率也隨之升高，從400 W時(shí)的382.34 mg·(100 g)-1升高到800 W時(shí)的481.56 mg·(100 g)-1，但600 W、700 W和800 W的花色苷提取效率并不存在顯著差異(圖b)。

提取時(shí)間越長，提取越充分，提取時(shí)間為25 min時(shí)花色苷的提取效率為481.45 mg·(100 g)-1，已達(dá)到了最高，再延長提取時(shí)間，花色苷的提取效率也沒有明顯地升高(圖c)。張華等指出，花色苷容易發(fā)生氧化和降解，提取時(shí)間過長雜質(zhì)會(huì)越多[6],所以超聲時(shí)間不宜過長。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，超聲輔助提取篤斯越桔花色苷的三個(gè)因素料液比、超聲功率和提取時(shí)間分別選擇1∶20、600 W和25 min為中間水平，為了更準(zhǔn)確地優(yōu)化提取工藝，各因素水平的取值范圍也進(jìn)行了適當(dāng)?shù)目s小。

微波輔助提取篤斯越桔花色苷的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表和結(jié)果如表1所示，由極差R可知，3個(gè)因素對(duì)提取效率影響的主次順序?yàn)榱弦罕?超聲功率>提取時(shí)間。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果分析得知，最佳提取條件為A3B3C2，即以1∶24的料液比、650 W的超聲功率和25 min的提取時(shí)間，提取3次，篤斯越桔鮮果的花色苷提取效率最高，為492.72 mg·(100 g)-1。

表1 超聲波輔助提取篤斯越桔花色苷的因素水平

3 小結(jié)

以大興安嶺地區(qū)采集的水濕地有土類型的野生篤斯越桔果實(shí)為試驗(yàn)材料，對(duì)越桔果實(shí)花色苷的提取工藝進(jìn)行研究。對(duì)影響越桔花色苷提取效率的幾個(gè)關(guān)鍵因素，即果實(shí)破碎方式、提取溶劑體系、提取方式和提取次數(shù)的分析結(jié)果表明：

(1)液氮研磨后越桔花色苷的提取效率明顯高于傳統(tǒng)的勻漿破碎處理；

(2)利用乙醇/水/鹽酸(80∶19∶1，V/V)溶劑體系提取花色苷的效率高且不存在安全性問題，連續(xù)3次超聲輔助提取的效果較好；

(3)對(duì)超聲輔助提取越桔花色苷工藝的優(yōu)化結(jié)果表明料液比1∶25、超聲功率650 W和提取時(shí)間25 min時(shí)，經(jīng)3次提取，水濕地有土類型篤斯越桔鮮果的花色苷提取效率最高，為492.72 mg·(100 g)-1。