龍 媛， 楊寶明， 黃玉玲， 白亭亭， 徐勝濤， 尹可鎖， 番華彩， 曾 莉， 李迅東， 郭志祥， 李永平， 楊德榮， 李進(jìn)平， 鄭泗軍，4*

1云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205； 2屏邊縣新華鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，云南 屏邊 661205； 3云南云天化股份有限公司，云南 昆明 650228; 4國際生物多樣性中心，云南 昆明 650205

香蕉枯萎病Fusariumoxysporum又稱香蕉黃葉病或巴拿馬病Panama disease,是由尖孢鐮刀菌古巴?；虵usariumoxysporumf. sp.cubense侵染而引起維管束壞死的真菌土傳病害，一旦發(fā)病則整株死亡，病菌蔓延速度快(黎永堅(jiān)和于莉，2006)。世界上主要香蕉產(chǎn)區(qū)均不同程度地受到香蕉枯萎病的危害(肖愛萍和游春平，2005)。香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種熱帶型最初從印度尼西亞傳入到我國臺(tái)灣省，然后從臺(tái)灣擴(kuò)散到廣東(1996年)、福建(2001年)、海南(2002年)、廣西(2006年)和云南(2009年)等地(Zhengetal.,2018a,2018b)。2009年7月，云南西雙版納勐臘縣香蕉產(chǎn)區(qū)首次發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病，感病香蕉15萬株，發(fā)病面積超過2000 hm2,該病發(fā)展迅速，給當(dāng)?shù)叵憬懂a(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失(曾莉等，2016)。

香蕉枯萎病菌是兼性寄生菌，腐生能力很強(qiáng)，可在土壤中存活長達(dá)30年，很難根治(王振中，2006)。目前，防控香蕉枯萎病主要通過化學(xué)藥劑、生物防治、抗病品種選育等方法，其中選育抗病品種是解決香蕉枯萎病的有效途徑(劉文清等，2010； Siamak & Zheng，2018)。20世紀(jì)80年代，臺(tái)灣選育出一些對(duì)香蕉枯萎病具有較好抗耐性的香蕉品種。2006年，廣東省選育并審定的抗枯5號(hào)是我國大陸第一個(gè)香蕉枯萎病抗病品種,之后陸續(xù)審定了其他幾個(gè)抗病品種。但總體而言，我國目前選育的抗枯品種還很少，并且抗性不強(qiáng)(黃素梅等，2014)。香蕉枯萎病的發(fā)生與香蕉品種的抗性、環(huán)境條件、土壤中病原菌數(shù)量等因素有關(guān)(何欣等，2010)。施用有機(jī)肥對(duì)香蕉枯萎病起到一定的防控作用(王瑾等，2017)，室內(nèi)研究表明，木霉菌株(唐孜等，2006)和枯草芽孢桿菌(周登博等，2016)對(duì)香蕉枯萎病菌有抑制作用。土壤中拮抗菌的種類和數(shù)量會(huì)直接影響香蕉枯萎病菌的數(shù)量，當(dāng)拮抗菌的種類增加時(shí)不利于香蕉枯萎病菌的繁殖和侵染(周博登等，2016)。

由于各個(gè)地區(qū)的香蕉枯萎病菌遺傳背景不同，可能會(huì)導(dǎo)致香蕉種質(zhì)抗病性的地區(qū)性差異(宋曉兵等，2016)。近年來，西雙版納地區(qū)的香蕉園正遭受枯萎病的嚴(yán)重威脅，導(dǎo)致許多發(fā)病蕉園地被撂荒。若改種旱地作物，需8年以上才可以再種香蕉，若改種水生作物，2～3年可再種香蕉。但在云南種植香蕉一般多為山地和坡地，不適合種植水生作物，這種趨勢(shì)必將導(dǎo)致香蕉種植面積減少，直接威脅香蕉產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展(李燕和張林，2016)。因此，選育適宜本地區(qū)的抗病新品種和探索有效的施肥方法成為當(dāng)務(wù)之急。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗(yàn)地

供試香蕉品種：生產(chǎn)上的主栽感病品種巴西蕉Brazilian和桂蕉1號(hào)Guijiao No1. 、抗病品種南天黃Nantianhuang 、自主選育品種云蕉1號(hào)Yunjiao No1.，其中云蕉1號(hào)是由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所選育出的香蕉枯萎病抗病新品種。所有供試香蕉苗均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源研究所農(nóng)業(yè)生物多樣性與香蕉研究室提供組培苗。一級(jí)組培苗經(jīng)過苗床煉苗而成二級(jí)苗。

供試肥料：常規(guī)有機(jī)肥、蝦肽有機(jī)肥、蝦肽特護(hù)、蝦肽果葉康、微生物制劑(主要包含白僵菌、綠僵菌、放線菌、硅酸鹽芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、木霉菌、光合菌、酵母菌等)、復(fù)合肥(15-15-15S)、磷酸二銨(17-42-0)、尿素、磷酸鉀、復(fù)合肥(15-15-25S)均由云南云天化股份有限公司提供。

試驗(yàn)地位于云南省景洪市勐罕鎮(zhèn)橄欖壩(東經(jīng)100°56′13″，北緯21°51′43″；海拔540 m)，為已連續(xù)種植10年的香蕉地，種植感病品種巴西蕉的發(fā)病率在90%以上，土壤已經(jīng)遭受香蕉枯萎病4號(hào)生理小種熱帶型TR4的侵染。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同抗性香蕉品種定植及施肥設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用裂區(qū)設(shè)計(jì)，分別設(shè)置3個(gè)處理為3個(gè)大區(qū)，每個(gè)大區(qū)種4個(gè)品種，每個(gè)品種5次重復(fù)，一次重復(fù)種植30株香蕉。每個(gè)試驗(yàn)大區(qū)20個(gè)小區(qū)，3個(gè)試驗(yàn)大區(qū)共計(jì)60個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積135 m2，共計(jì)8100 m2。

處理1(對(duì)照)施用常規(guī)有機(jī)肥(基肥)0.750 kg·m-2；處理2(蝦肽有機(jī)肥處理)施用蝦肽有機(jī)肥(基肥)+蝦肽特護(hù)+蝦肽果葉康，施用量分別為0.750 kg·m-2、0.100 kg·株-1、0.020 kg·株-1；處理3(微生物處理)施用常規(guī)有機(jī)肥(基肥)+微生物制劑，施用量分別為0.750 kg·m-2、0.005 kg· m-2(灌根)、0.300 g·m-2(噴葉)。3個(gè)處理都施用復(fù)合肥(15-15-15S)、磷酸二銨(17-42-0)、尿素、硫酸鉀和復(fù)合肥(15-15-25S)，施用量分別為0.750 kg·m-2、0.030 kg·m-2、0.200 kg·株-1、0.070 kg·株-1、0.050 kg·株-1，施用期均以2個(gè)葉齡為間隔期。處理2、處理3分別施入二氧化氯(0.003 kg·m-2)作土壤消毒處理。2016年6月23日定植，定植苗為生長至6～7片葉的二級(jí)苗。

1.2.2 土壤樣品實(shí)時(shí)定量PCR分析 種植香蕉后，即2016年7、8、9、10、11、12月，2017年1月，共計(jì)7個(gè)月，每個(gè)月各取樣一次。

土壤取樣方法：用土壤采樣器取香蕉植株根際周圍土壤，每個(gè)小區(qū)各隨機(jī)取4株香蕉根際周圍的土壤作為4次重復(fù)，每次重復(fù)取表土10～20 cm的5個(gè)點(diǎn)，并將5個(gè)點(diǎn)的土樣混合，再分別將同一小區(qū)的4次重復(fù)土樣混合為一份土樣。

土壤病原菌含量測(cè)定：土壤樣品采用Mo Bio Power Soil DNA Isolation Kit (Catalong No.12888-50)，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析土壤中枯萎病4號(hào)生理小種的孢子量，實(shí)時(shí)定量PCR采用Takara SYBR Premix Ex Taq TM (Tli RHase H Plus)試劑盒(Code NO.RR820)。引物和具體程序均參照Linetal. (2013),擴(kuò)增的目的片段大小為242 bp,標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立采用含有242 bp目的片段的重組質(zhì)粒PMD18-T-242,測(cè)定抽提的質(zhì)粒DNA的濃度，根據(jù)以下公式將質(zhì)粒DNA的濃度換算成拷貝數(shù)，設(shè)置1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copy number·μL-17個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線要求R2>0.99，90

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法 植株發(fā)病的判斷標(biāo)準(zhǔn)：以植株下部葉片黃化4片以上或假莖基部有2塊以上葉鞘開裂、裂縫大于10 cm為依據(jù)(劉文清等，2010)，統(tǒng)計(jì)定植后第5、7、9、11個(gè)月的發(fā)病植株數(shù)，計(jì)算累計(jì)發(fā)病率。

發(fā)病率%=(發(fā)病植株數(shù)/調(diào)查株數(shù))×100。

土壤枯萎病原菌月平均含量為60個(gè)試驗(yàn)小區(qū)所取土樣分別測(cè)得的病原菌含量的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中枯萎病原菌含量分析

目前尚無人對(duì)香蕉枯萎病重病地的病原菌含量動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)。本研究在香蕉種植一個(gè)月之后的2016年7、8、9、10、11、12月和2017年1月對(duì)蕉園土壤進(jìn)行取樣分析。種植香蕉后連續(xù)監(jiān)測(cè)的7個(gè)月份內(nèi)土壤中TR4的月平均含量差異比較大，動(dòng)態(tài)變化明顯(圖1)。最低含量均超過2000 copy number·g-1，最高達(dá)15148.9 copy number·g-1，說明種植香蕉的土壤中枯萎病原菌入侵嚴(yán)重。

圖1 土壤中TR4的含量Fig.1 The content of TR4 in the soil of the studied banana plantation

2.1.1 不同香蕉品種在常規(guī)有機(jī)肥處理(對(duì)照)中的發(fā)病率 由圖2可知，定植后第5個(gè)月巴西蕉、桂蕉1號(hào)、云蕉1號(hào)、南天黃的發(fā)病率分別達(dá)38.00%、33.00%、24.67%、16.67%，4個(gè)品種發(fā)病率差異顯著；定植后第7個(gè)月巴西蕉、桂蕉1號(hào)、云蕉1號(hào)、南天黃分別達(dá)69.33%、68.00%、46.00%、43.67%，巴西蕉和桂蕉1號(hào)發(fā)病率無顯著差異，與南天黃和云蕉1號(hào)有顯著差異；定植后第9個(gè)月巴西蕉、桂蕉1號(hào)、云蕉1號(hào)、南天黃的發(fā)病率分別達(dá)84.33%、82.66%、57.33%、49.00%，巴西蕉和桂蕉1號(hào)無顯著差異，南天黃和云蕉1號(hào)有顯著差異。南天黃與云蕉1號(hào)的發(fā)病率有顯著差異。定植后第11個(gè)月巴西蕉、桂蕉1號(hào)、云蕉1號(hào)、南天黃的發(fā)病率分別達(dá)93.00%、91.33%、62.67%、50.00%，巴西蕉和桂蕉1號(hào)無顯著差異，與南天黃和云蕉1號(hào)有顯著差異。南天黃與云蕉1號(hào)有顯著差異。這4個(gè)時(shí)期4個(gè)品種間的抗性均表現(xiàn)為南天黃>云蕉1號(hào)>桂蕉1號(hào)>巴西蕉。

圖2 4個(gè)香蕉品種的發(fā)病率(對(duì)照)Fig.2 Disease incidence of four banana varieties (CK)不同小寫字母表示同一時(shí)期不同品種在5%水平上差異顯著。

2.1.2 不同香蕉品種在蝦肽有機(jī)肥處理中的發(fā)病率 由圖3可知，定植后第5個(gè)月巴西蕉、桂蕉1號(hào)、云蕉1號(hào)、南天黃的發(fā)病率分別達(dá)36.00%、32.00%、22.00%、13.00%，4個(gè)品種的發(fā)病率差異顯著；定植后第7個(gè)月巴西蕉、桂蕉1號(hào)、云蕉1號(hào)、南天黃的發(fā)病率分別達(dá)67.66%、66.67%、43.33%、38.00%，巴西蕉和桂蕉1號(hào)無顯著差異，與南天黃和云蕉1號(hào)有顯著差異。南天黃與云蕉1號(hào)有顯著差異；定植后第9個(gè)月巴西蕉、桂蕉1號(hào)、云蕉1號(hào)、南天黃的發(fā)病率分別達(dá)82.00%、81.33%、53.00%、45.00%，巴西蕉和桂蕉1號(hào)無顯著差異，與南天黃和云蕉1號(hào)有顯著差異。南天黃與云蕉1號(hào)有顯著差異；定植后第11個(gè)月巴西蕉、桂蕉1號(hào)、云蕉1號(hào)、南天黃的發(fā)病率分別達(dá)91.67%、88.67%、60.67%、48.33%，巴西蕉和桂蕉1號(hào)無顯著差異，與南天黃和云蕉1號(hào)有顯著差異。南天黃與云蕉1號(hào)有顯著差異。這4個(gè)時(shí)期4個(gè)品種間的抗性均表現(xiàn)為南天黃>云蕉1號(hào)>桂蕉1號(hào)>巴西蕉。

圖3 4個(gè)香蕉品種的發(fā)病率(肽蝦有機(jī)肥處理)Fig.3 Disease incidence recorded in the four banana varieties under theshrimp peptide organic fertilizer treatment不同小寫字母表示同一時(shí)期不同品種在5%水平上差異顯著。

2.1.3 不同香蕉品種在微生物處理中的發(fā)病率 由圖4可知，定植后第5個(gè)月巴西蕉、桂蕉1號(hào)、云蕉1號(hào)、南天黃的發(fā)病率分別達(dá)32.67%、30.00%、18.83%、11.67%，4個(gè)品種的發(fā)病率差異顯著；定植后第7個(gè)月巴西蕉、桂蕉1號(hào)、云蕉1號(hào)、南天黃的發(fā)病率分別達(dá)59.33%、58.67%、37.67%、33.67%，巴西蕉和桂蕉1號(hào)無顯著差異，與南天黃和云蕉1號(hào)差異顯著。南天黃與云蕉1號(hào)有顯著差異；定植后第9個(gè)月巴西蕉、桂蕉1號(hào)、云蕉1號(hào)、南天黃的發(fā)病率分別達(dá)81.00%、80.33%、50.00%、41.00%，巴西蕉和桂蕉1號(hào)無顯著差異，與南天黃和云蕉1號(hào)有顯著差異。南天黃與云蕉1號(hào)有顯著差異；定植后第11個(gè)月巴西蕉、桂蕉1號(hào)、云蕉1號(hào)、南天黃的發(fā)病率分別達(dá)88.67%、87.66%、56.33%、47.00%，巴西蕉和桂蕉1號(hào)無顯著差異，與南天黃和云蕉1號(hào)有顯著差異。南天黃與云蕉1號(hào)有顯著差異。這4個(gè)時(shí)期4個(gè)品種間的抗性均表現(xiàn)為南天黃>云蕉1號(hào)>桂蕉1號(hào)>巴西蕉。

圖4 4個(gè)香蕉品種的發(fā)病率(微生物處理)Fig.4 Disease incidence of recorded in the four banana varieties under the microbial treatment不同小寫字母表示同一時(shí)期不同品種在5%水平上差異顯著。

2.2 施用不同肥料對(duì)香蕉枯萎病的防治效果

3個(gè)施肥處理間的發(fā)病率差異顯著，微生物處理、蝦肽有機(jī)肥處理的枯萎病發(fā)病率均降低，與對(duì)照相比,蝦肽有機(jī)肥處理在香蕉定植后第5、7、9、11個(gè)月的防治率分別達(dá)8.29%、5.00%、4.40%、2.60%；微生物處理在香蕉定植后第5、7、9、11個(gè)月的防治率分別達(dá)17.49%、16.60%、7.70%、5.80%，蝦肽有機(jī)肥處理和微生物處理的防治率均隨時(shí)間推移下降，說明這2個(gè)處理的防治效果由前期到后期逐漸減弱(表1)。

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)蕉園內(nèi)種植的4個(gè)品種均表現(xiàn)出較高的發(fā)病率，一定程度上說明本試驗(yàn)所選擇的蕉園枯萎病嚴(yán)重。試驗(yàn)地土壤中病原菌的月平均含量均超過室內(nèi)試驗(yàn)的發(fā)病臨界濃度，即香蕉枯萎病病原孢子懸液濃度1×103CFU·g-1(何欣等，2010)，土壤中枯萎病原菌含量高，具備土壤病原菌含量促使發(fā)病的條件，驗(yàn)證了品種在該條件下的抗性表現(xiàn)。

表1 不同施肥處理香蕉枯萎病發(fā)病率Table 1 The disease incidence of banana wilt in different fertilization treatments

同列數(shù)據(jù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)后不同小寫字母者表示在5%水平上差異顯著。

The data (means±SD) in the same column with the different letters mean significant differences at 5% level.

種植在試驗(yàn)區(qū)的4個(gè)香蕉品種的發(fā)病率存在顯著差異，特別是感病品種和抗病品種間發(fā)病率差異大。南天黃的抗性較強(qiáng)，云蕉1號(hào)較巴西蕉和桂蕉1號(hào)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，與徐勝濤等(2017)對(duì)這3個(gè)品種室內(nèi)抗性鑒定結(jié)果相吻合。

3種施肥處理間的發(fā)病率雖有顯著差異，但施肥處理對(duì)枯萎病的防治效果遠(yuǎn)低于品種自身抗性對(duì)枯萎病的防控效果。這說明通過抗病育種選育出抗性較高的品種是目前解決枯萎病危害最有效最直接的途徑，施用微生物制劑改良土壤條件也能降低發(fā)病率。這與現(xiàn)階段提倡對(duì)香蕉枯萎病采用“以選育抗病品種為主導(dǎo)，以綜合防控相應(yīng)配套措施為輔”的防控策略相應(yīng)證。在探索香蕉枯萎病綜合防治方法的同時(shí)不能忽視傳播途徑造成的影響，通過實(shí)施嚴(yán)格的種苗調(diào)運(yùn)檢疫,農(nóng)用工具和人員消毒等防范和隔離措施，防止該病害的進(jìn)一步傳播與蔓延(Zhengetal.，2018)。