孫萬霞，潘曉芳

（廣西大學(xué)林學(xué)院，廣西 南寧 530004）

【研究意義】板栗（Castanea mollissimaBlume）屬于殼斗科（Fagaceae）栗屬（Castanea），品種約有300多個［1］。目前我國板栗的栽培面積排在世界首位，板栗味道甘美，具有養(yǎng)胃健脾、補腎強筋、活血止血等功效，深受人們喜愛。且栽培歷史悠久，因板栗本身適應(yīng)范圍較為廣泛，抗逆性較強，同時又方便種植管理，板栗果實產(chǎn)量也相當(dāng)可觀［2］。因此，板栗成為我國最早馴化的經(jīng)濟(jì)林果實之一，廣西目前主要板栗栽培地點集中在河池、百色、桂林、南寧、憑祥等地。但隨著板栗種植面積的擴(kuò)大，板栗落果及果實病害的發(fā)生也日益嚴(yán)重，病害嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致果實腐爛、脫落，嚴(yán)重影響板栗產(chǎn)量。因此，對板栗采前落果及果實病害進(jìn)行深入調(diào)查及防治方法具有現(xiàn)實意義?！颈狙芯壳腥朦c】目前，板栗是隆安縣一個林業(yè)產(chǎn)業(yè)，在精準(zhǔn)扶貧中起到重要作用。由于板栗產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，已成為隆安縣農(nóng)民的重要經(jīng)濟(jì)收入來源，為廣西農(nóng)民收入增長提供了強有力的支持?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前已報道的文獻(xiàn)多為板栗種植或栽培等方面的研究，病害方面也只是對板栗葉、枝上發(fā)生的病害，未見對板栗果實病害方面的研究報道，缺乏針對廣西西北部板栗病蟲害調(diào)查及防治等方面的研究［3］。【擬解決的關(guān)鍵問題】為明確廣西隆安縣板栗采前落果及果實病害的發(fā)生情況，在隆安縣定軍村種植區(qū)開展板栗落果及病害種類調(diào)查，對其病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、致病性試驗［4］，并進(jìn)行采前落果及果實病害田間藥劑防治試驗，選出有效防治的藥劑，為板栗落果及果實病害防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地位于廣西南寧市隆安縣古潭鄉(xiāng)，屬于南亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫21.7℃，極端低溫-0.8℃，年均降雨量1 310.1 mm，年均蒸發(fā)量1 652.5 mm，空氣相對濕度80%，日照充足，四季差異較小，按平均候溫統(tǒng)計，該地區(qū)屬于春秋相連，夏長無冬或基本無冬，四季皆適宜耕作的地區(qū)［2］。土壤類型為赤紅壤，土層深厚，高達(dá)1 m以上，土壤pH值為4.71，屬于酸性土壤。

供試林分為隆安縣古潭鄉(xiāng)定軍村14 年生板栗林，樹高4～6 m，平均冠幅2.3 m×2.4 m，平均地徑22.5 cm，株行距5.0 m×4.5 m，郁閉度0.9。

病果于2017年8月26日采自隆安縣定軍村種植園“雙季板栗”品種果仁變黑病果。接種果采自隆安縣定軍村種植園“雙季板栗”品種健康果。

1.2 板栗果實病害危害情況調(diào)查方法

普查法：在2017年6月7日發(fā)病盛期進(jìn)行調(diào)查，對隆安縣板栗采取多點調(diào)查，共1～2次，在晴天中午以后調(diào)查。同一林分內(nèi)采取5點取樣，每點果實取樣數(shù)量不少于30個，觀察記錄發(fā)病果實數(shù)量，計算病果率和病情指數(shù)。調(diào)查記錄林分概況、起源、土壤情況、海拔、管理措施。

系統(tǒng)調(diào)查：2017年7—8月果熟期至收果期，每隔5 d，在調(diào)查林分內(nèi)采取5點取樣，每點果實取樣數(shù)量不少于30個，觀察記錄發(fā)病果實數(shù)量，計算發(fā)病率和病情指數(shù)，繪出田間病害消長曲線［5-6］。

1.3 果實主要病害的病原菌分離及純化［7-8］

1.3.1 病原菌培養(yǎng) 將病果用清水沖洗干凈，用0.1%氯化汞溶液浸泡消毒5～8 min，無菌水漂洗3次，將漂洗過的材料置于提前放有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸去表面水分后，在病害處取5 mm大小的小塊，將組織塊接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板上，每皿放 4～5個組織塊，每個組織部位重復(fù)5～6皿，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。

1.3.2 病原菌分離及純化 據(jù)菌落形態(tài)、菌絲顏色、菌落邊緣形狀等特征，對菌落進(jìn)行分類，在無菌環(huán)境下用鑷子分別將不同菌落的菌絲置于新的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。待菌絲長出后，用接種針從菌落邊緣挑取新鮮的菌絲接種到新的PDA平板上純化培養(yǎng)，反復(fù)純化培養(yǎng)，直至得到單一的菌種，對所得菌種進(jìn)行記錄，并且將純化后的菌種接種至PDA斜面培養(yǎng)基的試管中置于4℃冰箱備用。

1.3.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 對純化后的菌株進(jìn)行鏡檢，應(yīng)將純化后保存在4℃冰箱的菌種進(jìn)行活化，然后取菌絲接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板上，放入25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間后觀察其菌落形態(tài)、顏色等特征。采用插片法培養(yǎng)，在已接有病原菌的PDA培養(yǎng)基上45°角插入已經(jīng)滅菌的蓋破片，一定時間后取出，放于載破片上進(jìn)行鏡檢。并做好拍照記錄。根據(jù)菌落生長特征和顯微鏡下形態(tài)判斷絲狀真菌的種類。

1.3.4 病原菌致病性試驗 接種前，挑取菌落邊緣菌絲接種于PDA培養(yǎng)基上活化5 d后，再接種。選擇健康、大小基本一致的果實。將培養(yǎng)已活化的病原菌，用打孔器（直徑大小約為5 mm）打出大小一致的菌絲塊，進(jìn)行活體接種和離體接種。接種方式設(shè)針刺傷法和無傷接種法兩種，并以同大小空白PDA培養(yǎng)基處理作為空白對照。每接種方式不同處理均設(shè)置3次重復(fù)。試驗所用的板栗果實為健康無組織病害的近熟期果，并且接種前用75 %酒精消毒10 s，用無菌水沖洗3次以上。對于板栗果實的離體接種，根據(jù)其組織面積大小接種不同數(shù)量菌絲塊使用吸滿無菌水的濾紙放入一定大小的無菌培養(yǎng)皿中，并定期噴灑無菌水進(jìn)行保濕，各處理均置于25℃左右條件下進(jìn)行保濕培養(yǎng)，每天觀察并記錄發(fā)病情況?；铙w接種，將5 mm菌絲塊接種至75%酒精消毒并用無菌水沖洗3次的健康板栗果實，用無菌紙壓于菌餅上，再用橡皮筋固定，然后套袋保濕。使用5 mm空白PDA培養(yǎng)基塊處理作為空白對照。每種菌株及對照接種果實數(shù)為30個，設(shè)置3次重復(fù)。對于接種后發(fā)病的植株，對發(fā)病部位進(jìn)行病原再分離。若能得到相同的菌株，則可以確定其致病性；反之，則不能。

1.3.5 田間防治試驗方法 田間防治試驗地選擇隆安縣定軍村板栗示范基地，試驗時間為2017年7—8月，選擇12年板栗作為施藥對象，田間防治試驗藥劑的選擇參照已有文獻(xiàn)中報道的對果實病原菌殺菌效果最強的殺菌劑以及市場內(nèi)對板栗果實病害防治效果最強的單劑或混劑殺菌劑，即選擇2%春雷霉素800倍液、40%苯醚甲環(huán)唑1 000倍液、2%春雷霉素+40%苯醚甲環(huán)唑800～1 000倍液、20%噻菌銅800倍液及40%多菌靈800倍液進(jìn)行田間防治試驗，以清水為對照。因地勢原因板栗種植不規(guī)則，因此小區(qū)設(shè)隨機(jī)區(qū)組試驗，集中地區(qū)隨機(jī)區(qū)組設(shè)置6個小區(qū)，每個小區(qū)7株板栗，每小區(qū)對應(yīng)一種不同藥劑及清水對照，保證同一片地區(qū)每種處理的板栗株樹一致，每個處理3次重復(fù)。共噴藥3次，每次間隔15 d，最后一次噴藥15 d后調(diào)查板栗落果及發(fā)病情況。

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，對統(tǒng)計結(jié)果采用SPSS21.0進(jìn)行單因素方差分析及多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實病害調(diào)查結(jié)果分析

調(diào)查結(jié)果（表1）顯示，隆安縣板栗果實發(fā)病率在所調(diào)查的5個樣點中最小值為18.18%，最大值為38.00%，平均發(fā)病率為25.63%，病害嚴(yán)重影響果實質(zhì)量和產(chǎn)量，降低果農(nóng)經(jīng)濟(jì)收入，其次收獲期被感染的栗果與好果無明顯區(qū)別，但食用時具有苦味，感染嚴(yán)重的栗果在表面形成腐爛型、褐斑型和黑斑型3種壞死斑點［9］。

表1 病果率調(diào)查結(jié)果Table 1 Investigation result of the diseased fruit rate

2.2 致病性試驗結(jié)果分析

通過致病性試驗，將果實采摘并去苞處理，對病果進(jìn)行統(tǒng)計分析［10-12］，結(jié)果（表2）表明：接種不同菌株栗果發(fā)病率最大值為37.87%，最小值為24.35%，各處理平均發(fā)病率為29.97%；接種B、F菌株板栗果實病害發(fā)病率均高于空白對照，差值最大為7.90%；接種A、C、D、E菌株發(fā)病率均小于空白對照，最大差值為5.62%。致病性試驗后將病果病害部位進(jìn)行培養(yǎng)、分離及純化，最終得到3種菌株編號為B、D、F，與前期實地調(diào)查果實病害相一致，其病害發(fā)病率分別為29.17%、29.32%、37.87%。

2.3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

從發(fā)病果實樣本上經(jīng)多次分離純化及致病性試驗得到3種菌株，編號為B、D、F（表2）。根據(jù)菌落形態(tài)、菌落顏色、菌落質(zhì)地、生長速度、菌絲生長狀況及40倍鏡檢等方面分析。菌株B在PDA 培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)10 d即可長滿平板，生長初期為磚紅色、質(zhì)密，隨著菌絲增長后期為粉色，菌絲較發(fā)達(dá)短絨狀，生長速度慢，經(jīng)40倍顯微鏡鏡檢，菌絲成樹枝狀，有分支，稍彎曲，淡綠色。菌株D在PDA培養(yǎng)基28℃條件下菌落生長速度較快，整個菌落整齊而平坦，氣生菌絲絨狀或棉絮狀，菌落初期為白色，生長中期菌落中間出現(xiàn)灰黑色，后期漸變?yōu)楹谏?，在電子顯微鏡下觀察呈叢生網(wǎng)狀，有分支，淡綠色。菌株F 在 PDA 培養(yǎng)基28℃條件下菌落生長初期為淡粉色，后期為白色，橢圓形，邊緣缺刻，菌絲不發(fā)達(dá)，短絨狀，經(jīng)鏡檢菌絲呈樹枝狀，有分支球形，分生孢子梗數(shù)根叢生，具隔膜，稍彎曲，分生孢子聚生于小梗上，呈卵圓形或橢圓形，單胞，大小為8～14μm×7～11 μm，無色至淡色透明。

表2 致病性試驗統(tǒng)計結(jié)果Table 2 Statistical results of pathogenicity test

2.4 不同殺菌劑處理對板栗落果率及發(fā)病率的影響

本試驗結(jié)果（表3）顯示，各處理平均落果率在10.60%～43.54%之間。5種殺菌劑處理對板栗落果均有一定防治作用，其中多菌靈殺菌劑防治效果最佳，落果率為10.60%，苯醚甲環(huán)唑、噻菌銅、春雷霉素+苯醚甲環(huán)唑和春雷霉素4種處理落果率分別為20.67%、22.78%、24.52%和30.24%。結(jié)果表明落果率與對照相比均表現(xiàn)極顯著差異，且5種殺菌劑處理之間表現(xiàn)顯著差異，說明5種殺菌劑處理對板栗落果有一定的防治作用。

表3 不同殺菌劑處理對板栗落果率及果實病害率的影響Table 3 The effects of different fungicides treatment on the rates fruit drop and fruit diseases of chestnuts

由表3可知，在果實發(fā)病率中，各處理發(fā)病率最小為19.69%，最大為33.49%，總體平均值為27.16%。其中春雷霉素+苯醚甲環(huán)唑處理發(fā)病率最高，比空白對照高3.86個百分點，多菌靈藥劑處理果實發(fā)病率為19.69%，在6種處理中發(fā)病率最低，且與其余5種處理存在較大差異。

3 討論

本研究對廣西隆安縣板栗落果及病害情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該地域板栗采前落果主要是病害發(fā)生導(dǎo)致，感染嚴(yán)重的病果出現(xiàn)腐爛型、褐斑型、黑斑型等癥狀，這一調(diào)查結(jié)果與侯保林等［13］研究的栗仁斑點病有相似之處。板栗果實病害的發(fā)生與環(huán)境、栽培技術(shù)及管理措施存在一定的關(guān)聯(lián)性，為尋找板栗病害發(fā)生的主導(dǎo)因子，提出較好的營林措施。因此防治落果首先要加強管理技術(shù)，通過科學(xué)篩選殺菌劑，加強藥物用量或開展合理噴藥［14-16］。但因農(nóng)藥是多分子化學(xué)藥品，在自然狀態(tài)下大量使用不易揮發(fā)降解，對生態(tài)環(huán)境和人體有害，在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用一定濃度的農(nóng)藥勿過量，為了避免增強此類病害的抗藥性，多菌靈可以與上述3種殺菌劑交互使用［17］。由調(diào)查數(shù)據(jù)可知，對于板栗病害防治更應(yīng)加強栗林管理，減少樹體損傷，提高樹勢，采用預(yù)防為主綜合治理的手段，化學(xué)、物理及生物防治技術(shù)相結(jié)合，充分發(fā)揮各防治技術(shù)優(yōu)勢，取長補短，發(fā)揮總體作用，最終達(dá)到全面防治效果［18］。

4 結(jié)論

通過對14年生板栗果實落果及病害防治，結(jié)果表明：在自然生長狀況下，板栗采前落果和果實發(fā)病率隨著樹齡的增大，其落果率及發(fā)病率上升。板栗在自然生長狀態(tài)下其發(fā)病率最高可達(dá)38.00%，最低達(dá)18.18%，平均為25.63%。但若進(jìn)行多菌靈殺菌劑科學(xué)合理噴施，其發(fā)病率可明顯下降到19.69%。5種殺菌劑處理中，多菌靈對板栗病害防治效果最好，發(fā)病率最低；苯醚甲環(huán)唑、春雷霉素+苯醚甲環(huán)唑、噻菌酮也有一定防治效果［19］。在采果前，選擇應(yīng)用多菌靈800倍液在7—8月果實近熟期噴灑3次，效果顯著。另外，通過對果實病害部位的分離、純化及致病性試驗最終得到3種編號為B、D、F的菌株，與前期實地調(diào)查果實病害相一致。