渠星宇 邊永軍＊, 白 楊 沈 珍

(1晉中學院化學化工學院，晉中 030619)(2南京大學化學化工學院，配位化學國家重點實驗室，南京 210023)

鐵是人體血液中交換和輸送氧所必需的一種元素，體內(nèi)大部分鐵以離子形式分布在特殊的血細胞中[1]。人體中鐵離子含量過多或過少都會帶來疾病，甚至死亡。因此，準確及時地檢測生物體內(nèi)鐵離子的含量非常有意義[2]。目前檢測鐵離子的方法有很多，例如：原子吸收、耦合等離子質(zhì)譜法、電化學法、熒光分析法[3-6]等。熒光分析法作為一種新型發(fā)展起來的檢測方法，具有操作簡單、檢測速度快、無破壞性等優(yōu)點，已經(jīng)成為一種十分實用的檢測方法[7-8]。但熒光分析法中有一個急需解決的問題，即：需合成靈敏度高、選擇性好、溶解性好的熒光探針。硼氟二吡咯亞甲基(BODIPY)類熒光染料具有許多優(yōu)良的光物理性質(zhì)[9]，例如：摩爾吸光系數(shù)高，熒光量子產(chǎn)率高，結構易修飾等，已被廣泛地應用到設計合成Fe3+熒光探針。2005年Bricks等[10]首次報道了一種熒光增強型的Fe3+熒光探針，即在BODIPY熒光染料的中位引入大環(huán)，發(fā)現(xiàn)該大環(huán)可以選擇性地與 Fe3+配合(配位比為 1∶1)。隨后，多種 BODIPY 類探針被合成并被應用到檢測細胞中Fe3+的含量，即通過在BODIPY的母核中位引入羥胺基團[11]、N-吡啶基 N-噻吩基胺基[12]、2-喹啉噻吩基團[13-14]，利用光誘導電子轉(zhuǎn)移(PET)機理達到熒光強度改變的目的進而檢測細胞中Fe3+的含量。此外，在BODIPY母核的3-，5-位引入對羥基苯乙烯基[15-17]、對磺酸基苯乙烯基[18]、席夫堿類基團[19-21]，通過光誘導分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)機理引起探針光譜性質(zhì)的改變，達到檢測Fe3+。

測定溶液pH值的變化對于許多領域都有非常重要的意義，這些領域包括化學、生物、工業(yè)生產(chǎn)等[22]。對于生物分析方面，設計合成pH探針，用于檢測生物細胞的變化、生理反應過程等具有重要的意義[23]。 文獻報道，將(N，N-二甲基)胺基團[24-27]或者苯酚基團[28-29]作為pH值的識別基團，引入到BODIPY母核的中位，利用PET原理達到檢測溶液及生物細胞中pH值的目的。文獻報道把嗎啡啉基團[30-31]引入到 BODIPY 母核的 1-，7-或 3-，5-位或者2-，6-位，利用ICT或PET原理可以實現(xiàn)檢測溶液的pH值。

本論文選用熒光量子產(chǎn)率接近1的BODIPY化合物1作為熒光基團，選用對羥基苯乙烯基團作為功能基團，合理的將功能基團修飾到BODIIPY母核的3-位，得到探針2。盡管文獻曾報道[32]探針2通過化合物1和對羥基苯甲醛反應得到，但是產(chǎn)率較低且沒有研究該化合物的光物理性質(zhì)。本文選用吡啶-2-甲酸(4-甲?；椒?酯代替對羥基苯甲醛，與化合物1反應得到探針2，產(chǎn)率為39%。實驗結果表明，探針2基于ICT原理，可以識別弱酸性溶液的pH值，也可以選擇性地檢測生物細胞中的Fe3+含量。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

所有的試劑均為分析純，用到的無水CH2Cl2在CaH2中回流并蒸餾得到。無水乙腈采用色譜純。三乙胺采用簡單的蒸餾得到。

氫和碳的核磁共振圖譜均采用布魯克700 MHz核磁儀。高分辨質(zhì)譜采用Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL儀器?；|(zhì)輔助質(zhì)譜采用ultraflex TOF型儀器。吸收光譜采用TU-1901紫外光譜儀。熒光光譜采用Cary Eclips型熒光光譜儀。細胞成像實驗采用蔡司LSM880共聚焦激光掃描顯微儀。毒性試驗采用ELX808酶標儀。

1.2 合成探針2

探針2的合成路線見Scheme 1?；衔?由文獻報道的BODIPY類熒光染料經(jīng)典合成方法得到[14]。探針2采用Knoevenagel縮合反應，選用吡啶-2-甲酸(4-甲?；椒?酯與化合物1反應得到。

Scheme 1 Synthetic route for probe 2:わtriethyl formate and trifluoroacetic acid in CH2Cl2,triethylamine,DDQ,BF3·OEt2,r.t.;ぷ 3-formylphenyl picolinate,AcOH/piperidine,acetonitrile,reflux

探針2的合成方法：在100 mL的兩頸燒瓶中，加入 0.105 6 g(0.44 mmol)化合物 1，0.199 8 g(0.88 mmol)吡啶-2-甲酸(4-甲?；椒?酯，0.40 mL 無水哌啶，0.40 mL冰醋酸和50.0 mL無水乙腈。在氬氣保護下，使用分水器，加熱至沸，反應過程用薄層色譜(TLC)監(jiān)測，至化合物1全部消失。反應結束后，冷卻至室溫。反應液分別用水和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾得到粗產(chǎn)物。柱層析分離，展開劑用二氯甲烷，得到褐色固體，產(chǎn)率為39%。1H NMR(CDCl3，700 MHz)：7.47(d，J=7 Hz，2H)，7.45(d，J=21 Hz，1H)，7.21(d，J=21 Hz，1H)，7.01(s，1H)，6.83(d，J=7 Hz，2H)，6.66(s，1H),6.07(s,1H),5.46(s,1H),2.56(s,3H),2.29(s,3H),2.26(s,3H)。13CNMR(CDCl3,175 MHz)：156.77，156.00，154.58，140.85，140.48，136.44,135.00，133.70，129.40，119.03，118.49,116.83,115.87,115.46，14.97，11.58，11.54。 HR-MS(C20H20BF2N2O，[M+H]+)：計算值 353.163 6；實驗值 353.163 0。

1.3 測試熒光量子產(chǎn)率

探針2的熒光量子產(chǎn)率測試條件如下，選用羅丹明6G為標準，溶解到乙醇溶液中(ФF=0.88)，濃度為1μm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別為5 nm，激發(fā)波長選用546 nm，熒光光譜的積分范圍為550～700 nm。熒光量子產(chǎn)率(Yu)的計算公式為：Yu=Ys(Fu/Fs)(As/Au)(Gu2/Gs2)。Ys為羅丹明6G的熒光量子產(chǎn)率，F(xiàn)u為探針2的熒光光譜積分面積，F(xiàn)s為羅丹明6G的熒光光譜積分面積，Au為探針2在546 nm處的吸光度，As為羅丹明6G在546 nm處的吸光度，Gu為探針2在不同溶液中的折射率，Gs為羅丹明6G在乙醇溶液中的折射率。

1.4 識別金屬離子的實驗

將金屬離子(Ca2+，Ni2+，Na+，Co2+，Cd2+，Cu2+，Mg2+，K+，Hg2+，Al3+，F(xiàn)e2+)溶解到蒸餾水中，濃度為 1 mol·L-1。 Fe3+溶解到蒸餾水中，濃度為 0.2 mol·L-1。探針2溶解到甲醇和緩沖溶液的混合溶液中(V/V，1∶2)，濃度為10μmol·L-1。緩沖溶液選用醋酸與醋酸鈉配制的緩沖溶劑，pH為4.00。在滴定實驗中，每次取用探針 2(3 mL，10 μmol·L-1)到比色皿中，然后采用微量進樣器不斷加入Fe3+溶液。在選擇性實驗中，取用探針 2(3 mL，10 μmol·L-1)到比色皿中，然后加入60μL其他離子。

1.5 細胞成像實驗

HeLa細胞由中國科學院上海生化細胞所提供。HeLa細胞在37℃和5%(V/V)CO2條件下，于DMEM培養(yǎng)基(12%胎牛血清和1%抗生素)中培養(yǎng)。HeLa細胞貼在六孔板并孵育過夜，之后用PB(pH=6.00)溶液洗3次。探針2溶解到二甲基亞砜(DMSO)溶液中并加入到HeLa細胞中一起孵育并孵育30 min。探針2在培養(yǎng)基中的濃度為5μmol·L-1，多余的探針2用PB(pH=6.00)溶液清洗3遍，用作細胞成像實驗。同時，取用1份相同條件下的HeLa細胞，采用上述方法加入探針2，之后補加100μmol·L-1的FeCl3于培養(yǎng)基中孵育1 h，PB(pH=6.00)溶液洗1次，用作細胞成像實驗。

2 結果與討論

2.1 化合物1和2的光譜特性

化合物1和2在二氯甲烷溶液中的紫外可見吸收光譜圖和熒光光譜圖如圖1所示?；衔?和2均有經(jīng)典的BODIPY類熒光分子的吸收峰。探針2最大吸收峰位于573 nm，與化合物1相比，紅移了66 nm?；衔?的熒光峰位于581 nm，與化合物1相比，紅移了70 nm。主要原因是探針2在BODIPY母核的3-位引入對羥基苯乙烯基，增大了分子的共軛度。

圖1 化合物1和2在二氯甲烷溶液中的吸收光譜(實線)和熒光光譜(虛線)Fig.1 Absorption(solid line)and fluorescence(dash line)spectra of 1 and 2 in CH2Cl2

探針2在不同溶劑中光譜性質(zhì)如表1。從數(shù)據(jù)中可以看出，探針2的最大吸收峰和熒光峰沒有隨著溶劑極性的改變出現(xiàn)明顯的變化規(guī)律。探針2在乙腈溶液中的最大吸收峰和發(fā)射峰的波長最短，在DMSO溶液中最大吸收峰和發(fā)射峰的波長最長。探針2在不同溶劑中的熒光量子產(chǎn)率變化較大，在甲醇溶液中的熒光量子產(chǎn)率最高，為0.90。故而測試探針2對溶液pH值和Fe3+的響應時均采用甲醇與緩沖溶液的混合溶液。

探針2在表1中的各種有機溶劑中的溶解度均良好，但不溶于水。為了選取合適的混合溶劑，測試了探針2在不同比例甲醇和水中的吸收光譜和發(fā)射光譜。探針2在純甲醇溶液中最大吸收峰和發(fā)射峰依次位于570和585 nm，隨著混合溶液中水的比例加大，最大吸收峰的位置沒有改變，但是強度在下降 (圖2a、b)。當混合溶液中水的比例增大到67%(V/V)，探針2的最大吸收峰和發(fā)射峰的強度變化較?。划斔谋壤笥?7%(V/V)，探針2的最大吸收峰和發(fā)射峰的強度均有明顯的下降。同時，從拍照的圖片中可以明顯看到，無論是日光燈下還是在365 nm紫外燈下，混合溶液中水的比例應該控制在 67%(V/V)及更小(圖 2c、d)。

表1 化合物2在不同溶劑中的光譜數(shù)據(jù)Table 1 Spectroscopic properties of compound 2 in different solvents at 298 K

圖2 (a)探針2在甲醇和水不同比例混合溶液中的吸收光譜圖;(b)探針2在甲醇和水不同比例混合溶液中的熒光光譜圖;(c)探針2在不同甲醇與水混合溶液中(0%～86%,V/V)的照片;(d)在365 nm紫外燈下探針2在不同甲醇與水混合溶液中((0%～86%,V/V)的照片F(xiàn)ig.2 (a)Absorption spectra of probe 2 in CH3OH-water mixed solvents;(b)Fluorescence spectra of probe 2 in different CH3OH-water mixed solvents;(c)Photographs of the probe from CH 3OH-water mixed solvents(0%～86%,V/V);(d)Photographs of probe 2 from CH3OH-water mixed solvents(0%～86%,V/V)under UV lamp of 365 nm

2.2 探針2對弱酸溶液pH值的識別

探針2的吸收光譜和熒光光譜隨溶液pH值的變化曲線見圖3和圖4。探針2在不同pH值溶液中的吸收曲線表明，當溶液的pH≤6.00時，溶液的最大吸收峰位于570 nm并且它的強度在酸性范圍內(nèi)隨著pH值的減小略有下降；當溶液的pH≥7.00時，溶液的最大吸收峰位于600 nm并且它的強度在中性及堿性范圍內(nèi)隨著pH值的增大略有下降。同時詳細地測試了溶液pH值在6.00～7.00范圍內(nèi)，當不斷加入NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值時，探針2在570 nm處的吸收峰不斷下降，同時在600 nm的吸收峰不斷升高。同時從圖片上可以清晰地看到，探針2在pH＜6.00時顯示粉紅色，pH值在6.00～7.00范圍，由粉紅色逐漸變?yōu)樗{色，pH＞7.00為藍色。實驗結果表明探針2可以作為“裸眼”pH探針。

圖3 (a)在甲醇-水混合溶劑(67%,V/V)中,探針2在最大吸收峰處的吸光度隨溶液pH值變化的曲線;(b)在不同pH值(6.00～7.00)下,探針2的吸收光譜變化;(c)探針2在不同pH值(1.00～14.00)下的照片F(xiàn)ig.3 (a)Effect of pH value on the absorption intensity of probe 2 in CH3OH-water mixed solvents(67%,V/V);(b)Absorption spectrum change of probe 2 at different pH values(6.00～7.00);(c)Photographs of probe 2 at different pH values(1.00～14.00)

圖4 (a)在67%(V/V)的甲醇和水混合溶液中,探針2在585 nm處的熒光強度隨溶液pH值變化的曲線;(b)在不同pH值(6.00～7.00)下探針2的熒光光譜變化;(c)在365 nm紫外燈下探針2在不同pH值(1.00～14.00)下的照片F(xiàn)ig.4 (a)Effect of pH value on the fluorescence intensity of probe 2 in CH3OH-water mixed solvents(67%,V/V);(b)Fluorescence spectrum change of probe 2 at different pH values(6.00～7.00);(c)Photographs of probe 2 at different pH values(1.00～14.00)under UV lamp of 365 nm

探針2的熒光曲線隨溶液pH值的變化表明，當溶液的pH≤6.00時，溶液的最大發(fā)射峰位于585 nm并且發(fā)射峰的強度在酸性范圍內(nèi)隨著pH值的減小略有下降；當溶液的pH≥7.00時，溶液的熒光峰消失。同時詳細地測試了溶液pH值在6.00～7.00范圍內(nèi)，當不斷加入NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值時，探針2在585 nm處的發(fā)射峰波長不變，強度不斷下降。同時從圖片上可以清晰地看到，探針2在pH＜6.00顯示紅色的熒光，pH值在6.00～7.00范圍，紅色熒光在不斷消失，pH＞7.00時熒光完全消失。因此，探針2可以作為熒光探針用于測定溶液pH值。此外，利用Henderson-Hasselblad方程對滴定曲線進行擬合(圖4b插圖)，結果表明探針2的p Ka約為6.05。

2.3 探針2對常見金屬離子識別

圖5 加入各種金屬離子后探針2在甲醇和緩沖溶液(1∶2,V/V,pH=4.00)的吸收光譜圖 (a)和熒光光譜圖 (b);在日光燈 (c)和365 nm的紫外燈 (d)下,探針2在不同金屬離子中的照片F(xiàn)ig.5 Absorption(a)and fluorescence(b)spectra of probe 2 upon addition of different metal ions in CH3OH/Buffer(1∶2,V/V,pH=4.00)mixed solution;Photographs of probe 2 upon addition of different metal ions under sunlight(c)and UV lamp of 365 nm(d)

探針2對常見金屬離子(Ca2+,Ni2+,Na+,Co2+，Cd2+，Cu2+，Mg2+，K+，Hg2+，Al3+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+)的選擇性檢測見圖5。探針2溶解到甲醇和緩沖液(醋酸與醋酸鈉配制的緩沖液，pH=4.00)中，分別加入各種金屬離子，F(xiàn)e3+的加入量為探針2的400倍，其它金屬離子(Ca2+，Ni2+，Na+，Co2+，Cd2+，Cu2+，Mg2+，K+，Hg2+，Al3+，F(xiàn)e2+)的加入量為探針2的2 000倍，同時測試了該溶液的吸收光譜和熒光光譜圖 (圖5a、b)。吸收光譜圖表明，F(xiàn)e3+的加入改變了探針2的吸收光譜圖，最大吸收波長由570 nm變化到505 nm，藍移65 nm；Mg2+的加入，使得探針2的吸光度略有下降；其它金屬離子的加入均沒有引起明顯的變化。同時從照片中(圖5c)也可以清晰地看到Fe3+的加入使得探針2溶液的顏色變?yōu)辄S色。熒光光譜表明，F(xiàn)e3+的加入改變了探針2的熒光光譜圖，發(fā)射波長由585 nm變化到515 nm，藍移70 nm；Co2+，Cu2+的加入，使得探針2的發(fā)射峰的強度略有下降；其它金屬離子的加入均沒有引起明顯的變化。同時從照片中(圖5d)也可以清晰地看到Fe3+的加入使得探針2溶液在365 nm紫外燈下顯示綠色。實驗結果表明，探針2對Fe3+的檢測具有選擇性，并且能夠在溶液中“裸眼”檢測出Fe3+的存在。

2.4 探針2對溶液中的鐵離子的識別

探針2的吸收和熒光光譜隨著Fe3+加入發(fā)生相應變化曲線見圖6。吸收光譜圖及動力學曲線表明，隨著Fe3+的加入量的增大，探針2的吸收波長發(fā)生變化，570 nm處的吸光度在下降，505 nm處的吸光度在上升，當加入400倍的Fe3+時，505 nm處的吸光度為最大。熒光光譜圖及動力學曲線表明，隨著Fe3+的加入量的增大，探針2的發(fā)射波長發(fā)生變化，585 nm處的熒光峰在下降，515 nm處的熒光峰在上升，當加入160倍的Fe3+時，515 nm處的熒光強度為最大(圖6d)。探針2與Fe3+的熒光動力學曲線見圖 6e，采用如下公式歸一化：R=1-Ii/Imax，Ii為探針2與Fe3+反應后的熒光強度，Imax為探針2未與Fe3+反應前的熒光強度。熒光反應和Fe3+濃度的擬合曲線得到線性關系為y=0.495 3x-0.017 8，相關系數(shù)為0.991 4，可以計算出探針2檢測Fe3+的最低檢出限為0.36 mmol·L-1。實驗結果表明，探針2可以在溶液中檢測Fe3+的存在，并且探針2既是比率計量型的“裸眼”探針，又是比率計量型的熒光探針。

2.5 探針2對弱酸溶液pH值及Fe3+的識別機理研究

探針2與NaOH反應前后的氫核磁譜圖見圖7a。探針2分子結構中的3個-CH3化學位移值分別為2.49、2.32、2.28。 探針2與NaOH反應后-CH3化學位移值為2.43、2.26、2.21。與未加入NaOH比較，化學位移值略有下降。同樣，探針2與NaOH反應后苯乙烯基的化學位移值與探針2比較有較大的下降。參照文獻[29]，可以推測得到探針2在堿性條件下，3-位對羥基苯乙烯基失去羥基H質(zhì)子，變?yōu)檠踟撾x子。探針2與Fe3+反應前后的質(zhì)譜圖見圖7b。探針2的分子離子峰為352.155，探針2與Fe3+反應后的離子峰為277.123。參照文獻[21]，推測出加入Fe3+后，探針2分子結構中烯烴基團斷裂，氧化為羧酸基。

圖6 加入不同濃度的鐵離子后探針2在甲醇和緩沖溶液(1∶2,V/V,pH=4.00)的吸收光譜圖(a)和熒光光譜圖(c);(b)探針2在570和505 nm處吸光度隨著加入不同濃度鐵離子的變化曲線;(d)探針2在515和585 nm的熒光強度隨著加入不同濃度鐵離子的變化曲線;(e)探針2與Fe3+反應后歸一化的熒光強度隨Fe3+濃度變化的曲線Fig.6 Absorption(a)and fluorescence(c)spectra of probe 2 upon addition of Fe3+in mixed CH3OH/Buffer(1∶2,V/V,pH=4.00)solution;(b)Plot of absorbance vs Fe3+concentration at 505 and 570 nm;(d)Plot of fluorescence intensity vs Fe3+concentration at 515 and 585 nm;(e)Normalized fluorescence intensity of probe 2 after reacting with Fe3+as a function of Fe3+concentration

圖7 (a)探針2在氘帶甲醇中與NaOH反應前后的氫核磁譜圖;(b)探針2與Fe3+反應前后的質(zhì)譜圖Fig.7 (a)1H NMR spectra of probe 2 in CD3OD before and after the addition of NaOH;(b)MSspectra of probe 2 before and after the addition of Fe3+

2.6 探針2檢測細胞中鐵離子

探針2在活體細胞中對Fe3+的成像見圖8。37℃下，探針2在HeLa細胞中孵育30 min，用530 nm的光激發(fā)，可以看到細胞有紅色熒光；用485 nm的光激發(fā)，沒有看到熒光(圖 8a、b)。補加 100 μmol·L-1的Fe3+到細胞中，孵育1 h，用530 nm的光激發(fā)，沒有看到熒光；用485 nm的光激發(fā)，可以看到細胞有綠色熒光(圖8c、d)。同時從明場和交疊場可以進一步證明探針2可以檢測細胞中的鐵離子。細胞質(zhì)和細胞核染色強度比值較大(I2/I1＞20，圖9)，表明探針2主要染色到細胞質(zhì)上，細胞核染色較少。實驗結果表明，探針2具有較好的滲透性，可以很好地染色到細胞質(zhì)，并且能夠高效地檢測細胞中的鐵離子含量。

圖8 探針2在HeLa細胞中共聚焦熒光成像圖片、明場下圖片及交疊圖片:激發(fā)波長為530 nm(a)和485 nm(b)下,溫度為37℃時探針2在細胞中孵育30 min的圖片;激發(fā)波長為530 nm(c)和485 nm(d)下,溫度為37℃時細胞中補加100μmol·L-1的Fe3+孵育1 h的圖片;細胞在明場下的圖片(e,g);細胞在交疊下的圖片(f,h)Fig.8 Confocal fluorescence,bright field images and overlay images of probe 2 in HeLa cells:Cells incubated with 5 μmol·L-1 bright field of probe 2 for 30 min at 37℃upon excitation at 530 nm(a)and 485 nm(b);Cells supplemented with 100 μmol·L-1 of Fe3+in the growth media for 1 h at 37 ℃ upon excitation at 530 nm(c)and 485 nm(d);Bright field images of cells showed in panel(e,g);Overlay images of cells showed in panel(f,h)

圖9 (a)溫度為37℃時探針2在HeLa細胞中孵育30 min的共聚焦熒光成像圖;(b)分別單個細胞中細胞質(zhì) (1)、細胞核 (2)和細胞質(zhì) (3)所對應的熒光強度Fig.9 (a)Confocal fluorescence imaging of living HeLa cells incubated with probe 2 for 30 min at 37℃;(b)Fluorescence intensity profile across the line shown in panel A corresponding to cytoplasm(1),nuclear region(2)and cytoplasm(3)

探針2對細胞的毒性實驗見圖10。不同濃度(0～60μmol·L-1)的探針2孵育到細胞中，結果表明，孵育5 h后，20μmol·L-1的探針2細胞存活率達到100%，探針2濃度加到60μmol·L-1細胞存活率降到83%。孵育10 h后，20μmol·L-1的探針2細胞存活率達到100%，探針2濃度加到60μmol·L-1細胞存活率降到78%。上述結果表明，探針2濃度在0～60 μmol·L-1，孵育 10 h，都不會影響細胞的生存，說明探針2可以檢測細胞中的鐵離子含量。

圖10 探針2對細胞毒性試驗Fig.10 MTT of probe 2

3 結 論

通過改進Knoevenagel縮合反應，將對羥基苯乙烯基引入到BODIY的3-位，增加了分子的共軛度，得到了熒光探針2。探針2易溶于常見的有機溶劑，具有大的摩爾吸光系數(shù)和高熒光量子產(chǎn)率(＞0.60)。探針2在甲醇-水的混合溶劑中隨溶液pH值的增大發(fā)生波長紅移和熒光淬滅，可以作為“裸眼”探針檢測弱酸溶液的pH值。并且對溶液及活體細胞中的Fe3+表現(xiàn)出吸收和熒光光譜的比率計量型變化，且細胞毒性低，可以應用在生物體系中Fe3+的檢測。