摘 要 用液體侵染法從黃海分離出一株能夠侵染聚球藻WH8102的噬藻體S-H35。電鏡檢測結果顯示，S-H35屬于短尾科噬藻體。噬藻體S-H35的一步生長曲線顯示其潛伏期約為4 h，爆發(fā)期約為8 h，裂解量為125。S-H35的基因組分析結果顯示，其基因組長度為175， 321 bp，共含有228個ORF，GC含量為41.51%?；蚬δ芊譃槭稍弩w的結構、吸附相關、組裝、DNA復制及修復、末端酶、與宿主生理活動相關的基因等。噬藻體S-H35與已知的噬藻體進一步的基因比對結果并未顯示出明顯同源性。

關鍵詞 聚球藻 噬藻體 基因組

中圖分類號：X52 文獻標識碼：A

聚球藻（Synechococcus）是海洋藍細菌最主要的類群之一，也是超微型浮游生物中的優(yōu)勢組分，廣布于世界各大洋，它們在海洋中豐度極高，在熱帶和溫帶海洋中的豐度通常在103～105個/mL。聚球藻能量轉換迅速，在開放海域中的初級生產力可以達到總初級生產力的25%，是全球海洋中主要的初級生產者之一。此外，聚球藻是由2～4個單細胞組成的，具有結構簡單、易于培養(yǎng)的特點，因此一直是研究病毒感染的理想宿主。

噬藻體（Cyanophage）是一類能夠感染聚球藻、原綠球藻（Prochlorococcus）等藍細菌的病毒，其基因組大小介于30～60 kb之間，直徑一般在0.6～30 m之間。Safferman和Morris分離出第一株噬藻體“LPP”，它能夠同時感染鞘絲藻（Lynbya）、席藻（Phormidium）和織線藻（Plevtonema）三種宿主。隨后陸續(xù)有噬藻體純株被分離，到目前為止，共有幾百種不同的噬藻體被分離純化，而海洋聚球藻病毒的研究開始于1990年，之后很多聚球藻病毒被分離和研究。

新的海洋噬藻體的發(fā)現，進一步豐富了海洋噬藻體庫，并對進一步研究宿主-噬藻體之間的相互作用關系提供了實驗基礎。在本研究中，為海洋噬藻體基因庫提供了新的基因組信息，并為維持海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定及防止藻類污染提供了新的線索。

1材料與方法

1.1材料

使用液體侵染法（原海水）分離噬藻體。

用于分離噬藻體S-H35的海水樣品是采自中國北黃海海域H35站位（32？0N，122？2‘E）表層海水，采水量為1L。將水樣經0.22 m的濾膜過濾兩次，除去微微型生物及細菌，得到用于分離噬藻體的原海水；若病毒含量較低，用中型切向流將過濾后的海水濃縮100-1000倍，得到濃縮水樣，置于4℃黑暗條件下保存待用。

1.2實驗方法

1.2.1噬藻體的分離純化

將原海水與處于對數生長期的聚球藻按照體積比1：9的比例混勻，置于25癈，1000 lux光照條件的智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1周左右可以觀察到裂解現象。用雙層平板法對噬藻體進行純化，重復3次純化實驗，得到純凈噬藻體。

1.2.2噬藻體基因組的提取

液體侵染法富集病毒，用PEG濃縮法濃縮純化病毒，用于后續(xù)實驗研究（PEG濃縮病毒的方法參照Colombet等并加以改良）。

噬藻體基因組的提取方法具體參照Verheust等并加以改良。

1.2.3噬藻體的電鏡觀察

測定噬藻體的效價，當效價大于1010PFU/ml時，用移液器量取20 L的噬藻體樣品加到銅網上，置于室溫下15 min，加一滴2%的磷鎢酸，染色10 min用于電鏡觀察。

1.2.4噬藻體的一步生長曲線

（1）將噬藻體與其宿主按照0.01的比例混合均勻。

（2）將加入噬藻體的聚球藻置于25℃，1000 lux持續(xù)光照的環(huán)境中培養(yǎng)，加入后即開始計時。

（3）在0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h時分別取樣，并用25%的戊二醛進行固定。每個樣品都設置三個平行樣，分別測定后采用平均值。

（4）用流式細胞儀測定噬藻體的具體數值，以感染時間為橫坐標，以感染體系中的噬藻體不同時間的濃度為縱坐標，繪制噬藻體的生長曲線，通過計算得出噬藻體的潛伏期、裂解期和裂解量。

1.2.5噬藻體的宿主專一性鑒定

用JYS Red、TB、RCC2673、RCC753、RCC556、RCC2535、RCC307、TE4、CCMP1333、SW、WH8109、TB3 winter、TB2 winter、TB1 winter、KSHK01C、Prasce syn、YOKATA BAY、b3、WH7803、WH8102、MW01、MW02、MW03、LTW Red1、LTW Red2、MW15、SC7、b23、LTW Green 、PSHK05、KSHK03、PSHK01、KSHK05共33株聚球藻進行宿主專一性鑒定。

1.2.6噬藻體的基因組測序

對濃縮純化后的噬藻體高通量測序得到原始圖像數據文件，經CASAVA堿基識別（Base Calling）分析轉化為原始測序序列（Sequenced Reads），對測序數據進行過濾處理，去除包含Adapter的序列及低質量數據，得到的Clean Data用于后續(xù)分析。采用雙端測序的方法，對基因組樣品進行污染檢測后進行基因組拼接，采用SPAdes軟件進行序列拼接，得到原始Scaffold?；蚪M注釋使用進行編碼基因的預測，所采用的軟件是GeneMarkS（http：//topaz.gatech.edu/）。

2實驗結果

2.1噬藻斑的觀察

用雙層平板法培養(yǎng)噬藻體S-H35，置于25℃，1000 lux的恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周左右，即可觀察到直徑1 mm的半透明的噬藻斑，10天左右，噬藻斑的直徑可以擴大到1～2 cm。

2.2透射電鏡觀察

S-H35尾部很短幾乎不可見，因此推測屬于短尾病毒科，頭部直徑約為40 nm（圖1）。

2.3 S-H35的一步生長曲線

如圖2所示，噬藻體S-H35的潛伏期約為4 h，爆發(fā)期約為8 h，裂解量為125。

2.4 S-H35的宿主專一性鑒定

侵染結果顯示，S-H35除了能侵染聚球藻WH8102外，還能侵染聚球藻WH7803、LTW Red1和MW01，因此推測，噬藻體S-H35不具有種屬特異性。

2.5 S-H35的基因組分析

噬藻體S-H35的基因組長度為175321 bp，共含有228個ORF，基因的平均長度為649 bp，基因總長度占基因組總長度的比為84.4%，GC含量為41.3%，tRNA個數為8個，rRNA為1個。

對其ORF進行預測，統(tǒng)計結果為228個，其中有21個（9.2%）是檢索不到假定功能（putative function）的，在所有的ORF中，有74個（32.4%）能夠檢索到功能注釋的結果，有133（58.3%）個ORF未能推測其功能。

S-H35的基因組中，基因的功能，大概可分為以下幾類：噬藻體自身結構組成；DNA復制與修復、包裝；末端酶；以及對宿主藻的生理活動起輔助作用的基因。

為了研究噬藻體S-H35的系統(tǒng)發(fā)生分析，利用蛋白軟件和系統(tǒng)分析軟件Mega6.06進行系統(tǒng)發(fā)生分析。由于S-H35屬于短尾噬藻體，故選用短尾噬藻體的高度保守序列—DNA聚合酶基因所編碼的蛋白序列與選定的噬藻體的序列用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹。從圖3中可以看出，S-H35與Synechococcus phage ACG-2014c及Synechococcus phage syn9在進化上的關系更近。

3討論

噬藻體的基因組比對分析結果顯示，噬藻體S-H35跟其它噬藻體并未有顯著相似性。這證明S-H35是從海水中分離得到的新噬藻體，S-H35的基因組序列信息對于以后噬藻體的分子生物學研究能夠提供有用的基礎信息。一步生長曲線顯示，噬藻體的S-H35的裂解期較長，裂解量較大。

S-H35基因組中的基因大部分功能未知，但是從同源比對中可以發(fā)現，有3個（ORF88、ORF162、ORF181）與轉錄有關；2個（ORF23、ORF162）很可能與RNA的組裝有關； 8個（ORF24、ORF39、ORF87、ORF129、ORF144、ORF148、ORF171、ORF185）可能與DNA復制和修復有關，ORF24編碼DNA解旋酶，ORF39編碼DNA甲基化酶，ORF85編碼單鏈DNA結合蛋白；10個（ORF6、ORF52、ORF81、ORF133、ORF173、ORF191、ORF220、ORF221、ORF222、ORF228）與病毒包膜及結構有關；ORF228與病毒侵染循環(huán)有關；ORF148編碼的是短尾科病毒的保守序列DNA聚合酶，能夠保證噬藻體的基因組準確、迅速的復制以及產生更多的裂解后代。ORF143編碼MazG基因，具有高度的保守序列；除去與自身繁殖功能有關的ORF，S-H35基因組中也存在對宿主細胞有著重要功能的基因，如ORF107可以編碼光系ⅡD1蛋白，可以在宿主光系統(tǒng)受到強光損傷時，維持宿主的正常光合作用，滿足其對能量的需要。電泳檢測結果表明其為dsDNA，尾部很短幾乎不可見，因此推測屬于短尾病毒科。

核酸序列Accession Number：KY945241。

作者簡介：徐霞霞，1991年1月，女，山東省煙臺市人，中國海洋大學海洋生命學院2014級微生物學碩士，研究方向：海洋噬藻體。

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