趙遵嶺， 王雪慶， 楊璞

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，國(guó)家林業(yè)局資源昆蟲培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650224)

白蠟蟲Ericeruspela二齡雄蟲分泌的白蠟具有隔水防熱、潤(rùn)滑保濕、高熔點(diǎn)等特性，被廣泛應(yīng)用于食品包裝、精密儀器潤(rùn)滑固封、醫(yī)藥以及化妝品等行業(yè)(何晨柳等，2010；楊璞等，2012)。白蠟主要由二十六酸二十六酯、二十八酸二十八酯組成，另有二十四酸二十四酯、三十酸三十酯等(Yangetal.，2012)。在動(dòng)植物中，蠟酯主要通過(guò)?；€原途徑合成，首先由脂酰輔酶A還原酶(fatty acyl-CoA reductase，F(xiàn)AR)催化脂酰輔酶A還原為相應(yīng)脂肪醇，之后脂肪醇與脂酰輔酶A在蠟酯合酶的作用下酯化反應(yīng)成酯(Lardizabaletal.，2000；Metzetal.，2000；Yangetal.，2012；楊璞等，2012)。FAR為蠟酯合成途徑關(guān)鍵酶之一，在生物蠟酯的合成中扮演著不可或缺的角色。

在動(dòng)植物中，對(duì)人類Homosapiens與小鼠Musmusculus(Cheng & Russell，2004a，2004b)、擬南芥Arabidopsisthaliana(Rowlandetal.，2006；Lietal.，2008；Domergueetal.，2010)、家雞Gallusgallusdomesticus、家鵝Anseranserdomesticus、倉(cāng)鸮Tytoalba(Hellenbrandetal.，2011)等FAR進(jìn)行了基因克隆和表達(dá)、酶活性、組織表達(dá)定位等研究，表明FAR參與泌蠟的功能與其組織表達(dá)部位一致，一些物種的FAR的最適底物與生成蠟酯的脂肪醇一致。在昆蟲中，F(xiàn)AR的研究則主要集中在性信息素合成方面(Motoetal.，2003；Antonyetal.，2009；Liénardetal.，2010；Teerawanichpanetal.，2010)，而蠟酯合成的far基因相關(guān)信息很少?？寺『捅磉_(dá)昆蟲中參與蠟酯合成的far基因，對(duì)于闡述昆蟲蠟酯合成機(jī)理具有重要意義。

前期對(duì)白蠟蟲泌蠟高峰期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，篩選出了參與白蠟蟲泌蠟的far候選基因far1和far3(Yangetal.，2012)。后期獲得far2基因，F(xiàn)AR2體外酶活實(shí)驗(yàn)表明可催化C28脂酰輔酶A還原為C28脂肪醇(王雪慶，2018)，而白蠟蟲FAR3是否可以催化白蠟其他主要成分的生成，尚不清楚。本研究通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)擴(kuò)增得到白蠟蟲far3基因cDNA全長(zhǎng)，構(gòu)建原核表達(dá)載體，將far3基因在大腸桿菌Escherichiacoli中進(jìn)行表達(dá)，并進(jìn)行質(zhì)譜驗(yàn)證及活性分析，為后續(xù)單克隆抗體制備及FAR真核表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 供試材料

實(shí)驗(yàn)所用白蠟蟲二齡雄蟲采于云南省昆明市中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所人工大棚所種女貞Ligustrumlucidum樹上。

1.2 二齡雄蟲總RNA提取及RACE模板的合成

將白蠟蟲二齡雄蟲置于1.5 mL離心管中，依照Trizol試劑盒(Invitrogen，美國(guó))操作說(shuō)明提取總RNA，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取RNA的濃度以及純度，當(dāng)A260/A280為1.8～2.0時(shí)，說(shuō)明RNA純度較高。以提取的總RNA為模板，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit User Manual(Clontech，日本)操作說(shuō)明分別合成5’RACE和3’RACE模板。

1.3 RACE技術(shù)擴(kuò)增白蠟蟲far3基因

根據(jù)已獲得的far基因片段序列分別設(shè)計(jì)3’RACE和5’RACE特異性引物，并各以反轉(zhuǎn)錄3’RACE模板和5’RACE模板進(jìn)行序列3’端和5’端的擴(kuò)增，經(jīng)PCR及巢式PCR獲得目的條帶。擴(kuò)增體系為：10 μL 5×Q5 Reaction Buffer，1 μL 10 mmol·L-1dNTPS，0.5 μL Q5 High-Fidelity DNA Polymerase(NEB，美國(guó))，2.5 μL 10 μmol·L-1Forward Primer，2.5 μL 10 μmol·L-1Reverse Primer，2.5 μL cDNA模板，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR的反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃ 30 s；98 ℃ 8 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min充分延伸。

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠成像儀上切下對(duì)應(yīng)條帶，按照GeneJET Gel Extraction Kit試劑盒(ThermoFisher Scientific，美國(guó))操作說(shuō)明回收膠，最后加入20 μL預(yù)熱的滅菌ddH2O洗脫。然后對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行加A操作，加A體系為5 μL 10×PCR Buffer(Mg2+plus)，4 μL dNTP Mixture，0.5 μLrTaqDNA Polymerase(TaKaRa，日本)，20 μL PCR回收產(chǎn)物，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR儀中72 ℃反應(yīng)20 min，結(jié)束后立即置于冰上停止反應(yīng)?；厥占覣產(chǎn)物操作同上所述。

取加A回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接體系如下：2.5 μL Ligase Buffer，0.5 μL T4 Ligase(Promega，上海)，0.5 μL PGEM-T easy載體，1.5 μL加A回收產(chǎn)物，4 ℃過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa，日本)中，37 ℃ 160 r·min-1培養(yǎng)1.5 h后涂于氨芐抗性平板進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)藍(lán)白斑篩選獲得陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，陽(yáng)性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.4 序列分析

使用DNAMAN對(duì)測(cè)序結(jié)果拼接獲得far3基因序列全長(zhǎng)，并推導(dǎo)其開放閱讀框(ORF)及氨基酸序列，利用SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)分析FAR3序列。將其核酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，下載NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中其他物種的FAR氨基酸序列(圖2)，利用MEGA 5.05中Neighbour-Joining法、bootstrap置信度1 000次自導(dǎo)復(fù)制構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 原核表達(dá)載體構(gòu)建

將far3基因ORF序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并加入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，在其后加上增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因(eGFP)，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。將合成的基因序列連入pET-30a載體中，重組質(zhì)粒命名為pET-30a-eGFP/EpelFAR3。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，涂于Kan+抗性平板，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，陽(yáng)性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的菌液加甘油后-80 ℃保存。

1.6 原核表達(dá)SDS-PAGE分析

取10 μL測(cè)序成功的菌液于1 mL新鮮Kan+培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，按1∶100比例將過(guò)夜培養(yǎng)菌液加入4 mL新鮮Kan+LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.3左右，使用濃度為0.05 mmol·L-1的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，取1 mL菌液離心收集，并加入100 μL 1×protein loading buffer(TransGen Biotech，北京)懸浮，于-80 ℃過(guò)夜，取10 μL樣品經(jīng)100 ℃ 5 min變性后進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，電泳后經(jīng)FastBlue蛋白快速染色液(biosharp，安徽合肥)染色清洗后在GS-900(Bio-Rad，美國(guó))中掃描觀察。

1.7 Western blot驗(yàn)證

收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸浮，經(jīng)超聲波破碎后將上清與沉淀分別收集，沉淀為不可溶性蛋白，用2%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶解。將上清與SDS溶解沉淀蛋白分別進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育抗體，一抗為eGFP鼠抗(ABCam，美國(guó))，二抗為山羊抗小鼠IgG H & L(HRP)(ABCam，美國(guó))，洗膜后將超敏化學(xué)發(fā)光試劑(Affinity，美國(guó))A液與B液等量混合滴于膜上，在ChemiDoc XRS儀(Bio-Rad，美國(guó))中觀察。

1.8 質(zhì)譜分析

誘導(dǎo)表達(dá)的菌體蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后切取目的蛋白條帶于1.5 mL離心管中，并使用ddH2O漂洗2次，交由生工生物工程(上海)股份有限公司提取條帶蛋白并進(jìn)行LC-MSMS質(zhì)譜分析。操作步驟如下：使用Nano-RPLC Buffer A溶解樣品，利用Eksigent nanoLC-UltraTM2D系統(tǒng)(AB SCIEX，美國(guó))進(jìn)行在線Nano-RPLC液相色譜分析，使用C18預(yù)柱(100 μm×3 cm，C18，3 μm，150 ?)，以2 μL·min-1的流速上樣，并以此流速?zèng)_洗脫鹽10 min。采用C18反相色譜柱(75 μm×15 cm，C18，3 μm，120 ?，ChromXP Eksigent)作為分析柱，梯度洗脫程序?yàn)榱鲃?dòng)相B自5%按每3 min升高1%至35%。其中流動(dòng)相A為0.1%甲酸與2%乙腈的混合液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸和98%乙腈的混合液。

質(zhì)譜采用TripleTOF5600系統(tǒng)(AB SCIEX，美國(guó))與納升噴霧Ⅲ離子源(AB SCIEX，美國(guó))結(jié)合，噴霧電壓2.5 kV，氣簾氣壓30 PSI，霧化氣壓5 PSI，加熱器溫度150 ℃，采用信息依賴的采集工作模式進(jìn)行質(zhì)譜掃描。利用Mascot 2.3進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并與推導(dǎo)的白蠟蟲FAR3氨基酸理論序列理論質(zhì)譜圖進(jìn)行比對(duì)。

1.9 表達(dá)蛋白活性分析

取誘導(dǎo)表達(dá)的菌液1 mL，離心收集菌體，加入100 μL 10 mmol·L-1Tris-HCl(pH7.3)重懸浮，超聲波破碎。分別以C24脂酰輔酶A、C26脂酰輔酶A、C28脂酰輔酶A以及C30脂酰輔酶A等(Avanti，美國(guó))為底物對(duì)蛋白進(jìn)行活性檢測(cè)，反應(yīng)體系如下：2% dimethyl sulfoxide，2.5 mmol·L-1NADPH，脂酰輔酶A 1 μmol·L-1，10 μL表達(dá)蛋白，10 mmol·L-1Tris-HCl(pH7.3)補(bǔ)足至400 μL，30 ℃反應(yīng)40 min，加入400 μL氯仿停止反應(yīng)并萃取反應(yīng)產(chǎn)物，過(guò)濾。采用氣相色譜法檢測(cè)酶活反應(yīng)結(jié)果，氣相色譜(1890，惠普上海分析儀器有限公司)選用火焰電離檢測(cè)器與HP-5色譜柱，1 μL上樣量，程序如下：以250 ℃為色譜柱起始溫度，之后以5 ℃·min-1提升至280 ℃，維持10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 RACE結(jié)果與序列分析

RNA的A260/A280為1.92，濃度為280 ng·μL-1，可以作為RACE反轉(zhuǎn)錄的模板。3’RACE擴(kuò)增長(zhǎng)度為840 bp(圖1：A)，5’RACE擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 122 bp(圖1：B)，與保守序列拼接后獲得的基因全長(zhǎng)為1 849 bp，命名為far3基因，其中，ORF為1 566 bp，3’末端非編碼區(qū)121 bp，5’末端非編碼區(qū)162 bp。DNAMAN分析結(jié)果顯示，ORF編碼522個(gè)氨基酸，分子量約為60.07 kDa，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為9.02。

經(jīng)SMART分析，F(xiàn)AR3在26～297 aa處有一NAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域，496～518 aa處有一螺旋狀跨膜區(qū)域，其N末端在胞內(nèi)，沒(méi)有預(yù)測(cè)到信號(hào)肽序列。利用MEGA 5.05構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，白蠟蟲FAR3與人類、小鼠、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster等物種的FAR聚為一支(圖2)。

圖1 白蠟蟲far3基因RACE擴(kuò)增電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis results of RACE amplification of Ericerus pela far3 gene

圖2 不同物種FAR系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of FAR of different species

2.2 原核表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-30a-eGFP/EpelFAR3轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性單克隆，采用T7引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，目的基因距離上下游T7引物多出336 bp，目的條帶和eGFP共有2 283 bp，總計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為2 619 bp，檢測(cè)結(jié)果與之相符(圖3)。經(jīng)比對(duì)，測(cè)序結(jié)果與之相符。

在0.05 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)6 h后，成功表達(dá)FAR3-eGFP融合蛋白(圖4)。

2.3 Western blot驗(yàn)證

原核誘導(dǎo)表達(dá)的FAR3與eGFP融合蛋白分子量預(yù)計(jì)為86.84 kDa，經(jīng)Western blot結(jié)果分析，上清與菌體沉淀中均含有FAR3-eGFP的融合表達(dá)蛋白，且目的條帶位置與理論大小相符(圖5)，其中，上清中含有部分目的蛋白，說(shuō)明表達(dá)的該目標(biāo)蛋白有一部分是可溶的。

圖3 重組質(zhì)粒pET-30a-eGFP/EpelFAR3菌液PCR檢測(cè)Fig. 3 Agarose gel electrophoresis result of bacteria liquid PCR detection of pET-30a-egfp/EpelFAR3 recombinant plasmid

圖4 FAR3原核表達(dá)菌體總蛋白SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of total proteins of bacteria expressing FAR3

2.4 質(zhì)譜分析

經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，共有292個(gè)肽段與理論序列匹配，蛋白質(zhì)分值為3 900(圖6)，肽段覆蓋度74%，表明原核表達(dá)的白蠟蟲FAR3蛋白與理論蛋白肽段一致，目的基因表達(dá)成功。

圖5 FAR3原核表達(dá)菌體裂解后上清與沉淀蛋白的Western blot驗(yàn)證Fig. 5 Western blot verification of FAR3 prokaryotic expression in the supernatant and precipitation of bacteria lysate

圖6 蛋白質(zhì)分值質(zhì)譜分析結(jié)果Fig. 6 Mass spectrometric analysis of protein score

2.5 表達(dá)蛋白活性分析

經(jīng)氣相色譜檢測(cè)，原核表達(dá)蛋白FAR3在以C24脂酰輔酶A、C26脂酰輔酶A、C28脂酰輔酶A以及C30脂酰輔酶A為底物進(jìn)行活性分析時(shí)，沒(méi)有產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的脂肪醇(圖7)。

3 討論

FAR在生物體內(nèi)普遍存在，但參與的生理功能不同。西蒙得木SimmondsiachinensisFAR參與西蒙得木油的合成(Kalscheuer，2006)；而在家蠶Bombyxmori、歐洲玉米螟Ostrinianubilalis以及意大利蜜蜂Apismellifera等昆蟲中鑒定到的FAR參與信息素的合成(Motoetal.，2003；Antonyetal.，2009；Teerawanichpanetal.，2010)。擬南芥已鑒定的8個(gè)基因中FAR3參與根莖葉角質(zhì)層蠟的形成，F(xiàn)AR1、FAR4、FAR5則在根內(nèi)皮細(xì)胞中參與軟木脂的合成(Rowlandetal.，2006；Domergueetal.，2010)。研究表明，F(xiàn)AR的功能與組織表達(dá)部位關(guān)系很大，不同物種相同功能FAR的序列較為相似，功能相似的FAR在系統(tǒng)進(jìn)化分析中進(jìn)化關(guān)系較近(Johnsonetal.，2018)。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上通過(guò)RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得了白蠟蟲far3基因全長(zhǎng)及其ORF，并對(duì)ORF編碼蛋白FAR3與其他多個(gè)物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)白蠟蟲FAR3與人類、小鼠和果蠅等參與蠟酯合成的FAR聚為一支，此外，與泌蠟不相關(guān)的白蠟蟲熱激蛋白單獨(dú)一支，說(shuō)明白蠟蟲FAR3極可能在白蠟合成中起作用。

圖7 原核表達(dá)蛋白FAR3酶活反應(yīng)產(chǎn)物氣相色譜檢測(cè)Fig. 7 Gas chromatography detection peak map of the products from enzyme reaction of FAR3 expressed in prokaryotic cells

在原核誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，Zhang等(2015)發(fā)現(xiàn)增加IPTG濃度對(duì)形成可溶性蛋白會(huì)有不利影響，Saffarian等(2016)發(fā)現(xiàn)低濃度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)可產(chǎn)生更多可溶性蛋白。因此在誘導(dǎo)表達(dá)FAR3-eGFP融合蛋白時(shí)選擇較低的IPTG誘導(dǎo)濃度(0.05 mmol·L-1)。此外，誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致菌體密度過(guò)大，菌體生長(zhǎng)至平臺(tái)期，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)消耗殆盡，導(dǎo)致表達(dá)蛋白量不高，故設(shè)置誘導(dǎo)時(shí)間為6 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此誘導(dǎo)條件能成功表達(dá)大量目的蛋白。對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，蛋白質(zhì)分值為3 900，肽段覆蓋度為74%。在質(zhì)譜分析中，蛋白質(zhì)分值越高，質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果也更具可靠性。覆蓋度越高也表明所獲得肽段占理論序列比例越高，結(jié)果越可靠(Liuetal.，2004)，由此可以確定所測(cè)蛋白為目的蛋白。

動(dòng)植物FAR異源表達(dá)進(jìn)行酶活研究時(shí)，多采用真核表達(dá)系統(tǒng)，如意大利蜜蜂頭部分離出的FAR、擬南芥FAR5和FAR8以及小麥3種TaFAR在酵母細(xì)胞中表達(dá)成功(Teerawanichpanetal.，2010；Chacónetal.，2013；Wangetal.，2016)，人與小鼠的FAR在HEK293細(xì)胞中表達(dá)成功(Cheng & Russell，2004b)。但也有真核生物FAR在大腸桿菌中表達(dá)成功的例子，如Kalscheuer等(2006)在重組大腸桿菌中共表達(dá)了西蒙得木的雙功能?；o酶A還原酶和貝氏不動(dòng)桿菌AcinetobacterbaylyiADP1的蠟酯合成酶并獲得與西蒙得木相似的蠟酯；Doan等(2009)將來(lái)自于擬南芥與西蒙得木、蠶蛾、小麥及小鼠不同源的6種far基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，其中1種far基因表達(dá)蛋白沒(méi)有活性，其他5種far基因皆表達(dá)并催化生成了相應(yīng)的脂肪醇產(chǎn)物。

本研究通過(guò)原核表達(dá)獲得大量白蠟蟲FAR3蛋白，對(duì)其進(jìn)行活性分析。培養(yǎng)基上清中未檢測(cè)到表達(dá)蛋白，取誘導(dǎo)表達(dá)菌體破碎后上清進(jìn)行活性驗(yàn)證。另因白蠟主要成分為二十六酸二十六酯、二十八酸二十八酯，所以進(jìn)行蛋白活性檢測(cè)時(shí)選用C24脂酰輔酶A、C26脂酰輔酶A、C28脂酰輔酶A以及C30脂酰輔酶A為反應(yīng)底物。經(jīng)氣相色譜檢測(cè)無(wú)相應(yīng)理論脂肪醇產(chǎn)物的生成，可能是原核表達(dá)真核蛋白的翻譯后加工修飾體系不完善，不能形成正確的空間結(jié)構(gòu)，影響了生物活性(郭廣君等，2006)，也可能是酶活反應(yīng)條件不佳，催化生成產(chǎn)物少及萃取損失等原因?qū)е職庀嗌V無(wú)結(jié)果。但白蠟蟲FAR3的成功表達(dá)為抗體制備提供了抗原，后續(xù)白蠟蟲FAR3將采用真核表達(dá)進(jìn)行功能驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)RACE技術(shù)獲得了far3基因ORF 1 566 bp，構(gòu)建pET-30a-eGFP/EpelFAR3原核表達(dá)質(zhì)粒，以0.05 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)6 h時(shí)成功表達(dá)，經(jīng)Western blot及質(zhì)譜分析驗(yàn)證表達(dá)蛋白為白蠟蟲FAR3，氣相色譜檢測(cè)酶活反應(yīng)產(chǎn)物無(wú)相應(yīng)理論產(chǎn)物的生成。