岑娟 張峰

摘 ?要：目的 ?該文對從杜仲內生真菌發(fā)酵產生的多糖成分進行體外細胞毒活性篩選。方法 ?采用MTT法，用杜仲內生真菌多糖對7種腫瘤細胞進行體外細胞毒實驗。結果 ?實驗結果發(fā)現(xiàn)，杜仲內生真菌發(fā)酵產物中的多糖成分對HL-7702和Hela腫瘤細胞的IC50值分別為17.493.91和9.5216.24。結論 ?實驗結果表明杜仲內生真菌發(fā)酵產物杜仲多糖對部分腫瘤細胞具有一定的細胞毒作用。

關鍵詞：杜仲 ?內生真菌 ?抑菌作用

中圖分類號：S567 ? 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2019）12（c）-0156-02

植物內生菌代謝產物豐富多樣，活性作用也不盡相同，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、殺蟲和免疫抑制等生物活性，有一些內生菌還能產生活性物質，與宿主植物藥用成分相同。所以，在活性物質篩選和新藥研發(fā)方面，內生菌具有無窮潛力[1]。2003年，李雅等人[2]最早開始了對杜仲內生菌的研究，他們采用WA-抗生素培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基，從采自陜西楊凌的杜仲各個組織中分離到了49株內生真菌。然后，用蘋果腐爛病菌（Cyt-osporasp）作為致病菌株，對分離到的這49株內生真菌進行了抗菌活性測定，結果發(fā)現(xiàn)，有22株菌株對至少3種致病菌有顯著的抑制作用。Chen等人[3]研究發(fā)現(xiàn)，對從四川成都杜仲葉和樹皮中分離得到的29株內生真菌進行抗菌活性篩選后，發(fā)現(xiàn)大部分內生真菌都可以抑制供試病原細菌，但是抑制供試病原真菌的效果不太顯著。丁婷等人[4]研究發(fā)現(xiàn)，從杜仲中分離出32株內生真菌中，屬于梭孢殼屬的內生真菌DGS08對玉米紋枯病菌的生長有很好的抑制作用。該文對篩選出得杜仲內生真菌代謝產物多糖進行抗腫瘤活性篩選。

1 ?材料

1.1 試劑

青鏈霉素混合液（Solarbio），DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco），優(yōu)級胎牛血清（tbd science），二甲基亞砜（DMSO）（天津市富宇精細化工有限公司），四甲基噻唑藍（MTT）（Sigma）;胰蛋白酶（Trypsin）美國Amresco公司。

1.2 細胞株

MCF-7（人乳腺癌細胞株），K562（人慢性髓系白血?。?，HeLa（人宮頸癌），A549（肺腺癌細胞株），SMMC-7721（人肝癌細胞），HepG-2（人肝癌細胞系），MDA-MB-231（人高轉移性惡性乳腺癌細胞）：南京凱基生物技術股份有限公司。

HL-7702（正常人肝細胞）：中國科學院上海細胞庫。

1.3 儀器

500-831型全長酶標儀（Thermo Fisher Scientific），2424-2型CO2培養(yǎng)箱（上?？迫鹕锛夹g有限公司），TDL-50B型低速臺式離心機（舜宇儀器有限公司），JJ-CJ-2FD超凈化工作臺（吳江市凈化設備總廠產品）。

2 ?實驗方法

2.1 細胞的培養(yǎng)

將MCF-7、SMMC-7721、MDA-MB-231、K562、HL-7702、HeLa、HepG-2、A549在37℃，5%CO2條件下用含10%胎牛血清、青霉素1×105U/L及鏈霉素100mg/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞對數期。

2.2 MTT法檢測細胞活性

取對數生長期的各個細胞株按4×105/孔接種到96孔板中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24h后設置正常組（不加化合物），實驗組（100mg/mL、50L、5、1、0.5mg/mL）分別加到96孔板中，每個濃度設置6個平行復孔，繼續(xù)孵育48h后，在避光條件下每孔給予10μLMTT（5mg/mL），繼續(xù)放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4h后，棄去上清液，每孔加入100μL的DMSO（分析純）溶液，放置于室溫條件下，100rpm的震蕩箱下震蕩10min直至MTT反應的藍色結晶產物完全溶解，置于多功能酶標儀中，設置570nm的波長下檢測吸光度（Optical Density，OD），讀出OD值帶入公式中，求得細胞抑制率，并計算IC50值。實驗重復3次。

細胞抑制率%=（1-實驗組OD值/正常組OD值）×100%

3 ?實驗結果

由表1可知：杜仲多糖對MCF-7、SMMC-7721、MDA-MB-231、K562、HL-7702、HepG-2細胞作用48h后，對細胞沒有明顯的抑制率（P>0.05），從表中可以看出杜仲多糖對HeLa，A549細胞有明顯的抑制率（P<0.05），IC50值分別為17.49±3.91和9.521±6.24。

由圖1可知，不同濃度的杜仲多糖對A549細胞的生長均有一定的抑制作用。當杜仲多糖對A549細胞作用48h，濃度在0.5～5mg/mL抑制率波動不明顯，但有顯著性差異（P<0.01），隨著多糖濃度的增加，濃度在50mg/mL時對細胞的抑制率明顯增強（P<0.01），而且50mg/mL的時候抑制率為80%，達到一個平臺期，濃度在100mg/mL時抑制率為78%。

4 ?討論

在觀察杜仲多糖對細胞增殖的抑制作用時，我們首先采用MTT法來進行實驗，以篩選杜仲多糖有效作用濃度范圍及IC50，然后采用MTT法測定各實驗組細胞的生長抑制率。杜仲多糖各組作用HeLa，A549細胞后，其生長均受到了顯著的抑制。隨著濃度的升高，抑制率也不斷升高，說明藥物的作用具有濃度依賴性。

近年來多糖類的抗腫瘤作用引起了人們廣泛的注意，除可通過增強宿主免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用外，多糖還能通過誘導腫瘤細胞凋亡等途徑直接殺傷腫瘤細胞，從辛曉明的報道中可以看出杜仲總多糖具有顯著的腫瘤抑制作用，并能夠提高胸腺指數、脾指數、外周血白細胞計數和骨髓有核細胞計數，增強宿主免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用。

參考文獻

[1] 曾松榮，徐成東，王海坤，等.藥用植物內生真菌及其具宿主相同活性成分的機制初探[J].中草藥，2000，31（4）：306-308.

[2] 李雅，宋曉斌，馬養(yǎng)民，等.杜仲內生真菌對植物病原真菌的抑菌活性研究[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2007，35（2）：69-73.

[3] Chen XM， Sang YX， Li SH， et al. Studies on a chlorogenic acid-producing endophytic fungi isolated from Eucommia ulmoides Oliver [J].J Ind Microbiol Biotechnol，2010，37（5）：447.

[4] 丁婷，孫微微，韓亞惠，等.杜仲內生真菌DZJ07在小麥根際定殖及對根部酶活的影響[J].核農學報，2015，29（6）：1149-1157.