王 充，龍章德，孟丹丹，蘇 贊，劉 鴻，鄒克興，許春平*

1. 鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)科學(xué)大道136 號(hào) 450002

2. 廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，南寧市北湖南路28 號(hào) 530001

以煙梗、煙末和碎煙葉等煙草廢棄物為原料，利用造紙法原理加工生產(chǎn)的產(chǎn)品，稱造紙法再造煙葉［1-2]。造紙法再造煙葉生產(chǎn)過(guò)程中，以水為萃取劑對(duì)煙梗、煙末和碎煙葉等原料進(jìn)行浸提，然后將浸提液經(jīng)固液分離和高溫濃縮后的溶液，稱為造紙法再造煙葉濃縮液［3]。對(duì)再造煙葉的生產(chǎn)工藝技術(shù)的研究，尤其是微生物在再造煙葉生產(chǎn)上的應(yīng)用是煙草行業(yè)的研究熱點(diǎn)之一［4-8]。駱莉等［9]利用淀粉酶和糖化酶，以及生香酵母、植物乳桿菌等微生物對(duì)煙梗提取液進(jìn)行改良，結(jié)果表明煙梗提取液的香味成分增加，且能夠改善卷煙煙氣和口感；戴麗君等［10]、周蓉等［11]利用酵母對(duì)煙梗萃取液進(jìn)行發(fā)酵處理，處理后的萃取液與未發(fā)酵萃取液相比，萃取液香氣成分含量提高；張勃等［12]利用從紅花大金元品種煙葉表面分離的菌株對(duì)煙梗水提物進(jìn)行發(fā)酵處理，處理后煙梗水提物的再造煙葉樣品香氣豐度與香氣量增加、木質(zhì)雜氣減少、細(xì)膩性與甜潤(rùn)感改善,抽吸品質(zhì)有較大提高。因此，利用有益微生物能夠提高再造煙葉品質(zhì)。

目前對(duì)煙葉和煙田土壤中的微生物群落已有較多報(bào)道［13-14]，對(duì)微生物的開(kāi)發(fā)利用大多集中于煙葉或煙田及其他材料中分離得到的菌株，并將其應(yīng)用于煙葉醇化發(fā)酵以改善煙葉品質(zhì)，對(duì)造紙法再造煙葉方面的報(bào)道也僅限于煙草萃取液中的細(xì)菌群落組成研究［15]，其他真菌群落及相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，以造紙法再造煙葉濃縮液為研究對(duì)象，應(yīng)用MiSeq 測(cè)序平臺(tái)對(duì)真菌18S rDNA 和細(xì)菌16S rDNA 測(cè)序，研究濃縮液內(nèi)微生物真菌和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，并利用其內(nèi)部微生物進(jìn)行發(fā)酵，卷制再造煙葉單料煙評(píng)價(jià)其發(fā)酵效果，旨在為有益微生物在造紙法煙草薄片上的應(yīng)用提供支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2016 年8 月在河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司的造紙法再造煙葉生產(chǎn)車間取煙草片基100 g，另取再造煙葉濃縮液500 mL 樣品4 個(gè)，并將收集的濃縮液樣品在無(wú)菌條件下混勻?yàn)? 個(gè)試驗(yàn)樣品，于-10 ℃條件下帶回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品基因組DNA 提取

使用Stool Genomic DNA kit 試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號(hào)：CW2092S）提取樣品基因組DNA。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增和MiSeq 測(cè)序

對(duì)細(xì)菌16S rDNA 的V3～V4 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段為470 bp，引物為16s-f：PE1-CCTACGG GNGGWGCAG 和 16Ss-r：PE2-GACTACHVGGG TATCTAATCC（ PE 為測(cè)序接頭，大小為70 bp）。對(duì)真菌18S rDNA 的V4 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段為180 bp，引物 為18s-f：PE1-GCGGTAATTCCAG CTCCAA 和18s-r：PE2-AATCCRAGAATTTCACC TCT。PCR 反應(yīng)體系終體積為25 μL，DNA 聚合酶為KAPA HiFi DNA 聚合酶。16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，循環(huán)25 次；最后72 ℃延伸10 min。18S rDNA 的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s、循環(huán)25 次；最后72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目標(biāo)條帶檢驗(yàn)合格后，使用MiSeq 測(cè)序，測(cè)序委托上海祥音生物科技有限公司完成。

1.2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析

①去除Miseq 測(cè)序時(shí)加入的引物和接頭序列，再根據(jù)PE reads 之間的overlap 關(guān)系，將成對(duì)的reads 拼接成1 條序列，然后按照Barcode 標(biāo)簽序列識(shí)別并區(qū)分樣品得到數(shù)據(jù)；②使用Usearch 和Uchime 及 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（RDP 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 、Silva 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 和NCBI 16S 數(shù)據(jù)庫(kù)）去除非特異性擴(kuò)增序列和嵌合體，得到有效序列。③根據(jù)序列間的相似性在97%水平上將序列分成不同的操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）聚類，然后在OTU 聚類結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇豐度最高的序列作為OTU 的代表性序列進(jìn)行各類OTU 分析。 ④從每個(gè)OTU 中選擇1 條代表序列，使用RDP classifier 2.2 依據(jù)GreenGenes 數(shù)據(jù)庫(kù)為OTU 序列分配分類單元，并定義分類單元中相對(duì)豐度低于0.5%的類別都?xì)w為其他種群，相對(duì)豐度大于5%的種群定義為優(yōu)勢(shì)菌。使用OriginPro9.0 根據(jù)分類單元內(nèi)的種群豐度繪制每個(gè)分類單元的餅狀圖。⑤使用Mothur 1.31.2 軟件計(jì)算樣品的Coverage 和Alpha 多樣性指數(shù)，包括香農(nóng)指數(shù)（Shannon Index）、ACE 指數(shù)、Chao 1 指數(shù)、辛普森指數(shù)等［16-17]。

1.2.4 濃縮液發(fā)酵與化學(xué)成分測(cè)定

取50 mL 濃縮液于錐形瓶中，放置在搖床內(nèi)發(fā)酵24、48 和72 h，搖床內(nèi)溫度為30 ℃，振蕩速率120 r/min。采用標(biāo)準(zhǔn)方法［18]測(cè)定還原糖和總糖含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

1.2.5 再造煙葉樣品評(píng)吸

取未發(fā)酵和發(fā)酵24、48 和72 h 后的濃縮液以39%涂布率涂布在煙草片基上，在（40±2）℃的烘箱內(nèi)烘干后置于相對(duì)濕度（65±2）%，溫度（22±2）℃恒溫恒濕箱中48 h，分別切絲和卷制成單料煙。再將單料煙在溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（60±5）%的恒溫恒濕箱中平衡48 h 后，由廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品室具有評(píng)吸資質(zhì)的技術(shù)人員8 人按照標(biāo)準(zhǔn)方法［19]進(jìn)行評(píng)吸。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

再造煙葉濃縮液的化學(xué)指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3 次，計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。利用SPSS 軟件用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行處理間差異顯著性的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃縮液微生物的群落結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 濃縮液微生物18S rDNA 和16S rDNA 的PCR 產(chǎn)物分析

由圖1 可知，16S rDNA 的V3-V4 區(qū)域擴(kuò)增片段 在500 bp 左 右 ，18S rDNA 的V4 區(qū) 域 擴(kuò) 增 片 段在250 bp 左 右 ，18S rDNA 和16S rDNA 的PCR 產(chǎn)物條帶清晰明亮，無(wú)雜帶，擴(kuò)增片段大小與預(yù)設(shè)擴(kuò)增片段大小一致，表明PCR 產(chǎn)物可進(jìn)行下一步測(cè)序分析。

圖1 濃縮液微生物的18S rDNA 和16S rDNA 的PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of 18S rDNA and 16S rDNA PCR products of microorganisms in concentrated liquid

2.1.2 濃縮液微生物測(cè)序分析

對(duì)造紙法再造煙葉濃縮液內(nèi)真菌18S rDNA和細(xì)菌16S rDNA 的有效序列進(jìn)行計(jì)算得到微生物多樣性指數(shù)，見(jiàn)表1。由表1 可知，濃縮液內(nèi)真菌18S rDNA 和細(xì)菌16S rDNA 測(cè)序的覆蓋度均大于95%，說(shuō)明樣品測(cè)序結(jié)果代表了樣本內(nèi)微生物的真實(shí)情況；18S rDNA 的序列數(shù)大約是16S rDNA序列數(shù)的4 倍，若以序列數(shù)代表微生物的數(shù)目，造紙法再造煙葉濃縮液內(nèi)的真菌占總微生物的80.98%，細(xì)菌占總微生物的19.02%；造紙法再造煙葉的濃縮液真菌18S rDNA 共形成548 個(gè)OTU，細(xì)菌16S rDNA 共形成5 295 個(gè)OTU，18S rDNA 序列的香農(nóng)指數(shù)、ACE 指數(shù)、Chao1 指數(shù)明顯低于16S rDNA 序列，辛普森指數(shù)高于16S rDNA 序列，說(shuō)明濃縮液內(nèi)的真菌豐富度和多樣性低于細(xì)菌。

2.1.3 濃縮液中微生物的門水平多樣性分析

利用GraPhlAn 軟件，對(duì)造紙法再造煙葉的濃縮液真菌產(chǎn)生的548 個(gè)OUT，根據(jù)每個(gè)樣本的分類學(xué)比對(duì)結(jié)果選出優(yōu)勢(shì)物種，再結(jié)合物種豐度信息生成環(huán)形樹(shù)狀圖，見(jiàn)圖2。

表1 造紙法再造煙葉濃縮液微生物多樣性指數(shù)分析Tab.1 Microbial diversity index analysis of concentrated liquid of paper-making reconstituted tobacco

圖2 微生物群落分類與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀圖Fig.2 Classification and phylogenetic tree of microbial communities

圖2 中部為豐度前100 個(gè)物種進(jìn)化分類屬，并將豐度前20 個(gè)物種（以星號(hào)標(biāo)出）所對(duì)應(yīng)的門按不同的顏色標(biāo)出，分別為A 梭菌屬（Clostridium sensu stricto）、B 鏈球菌屬（Streptococcus）、C 酸桿菌屬（Lactobacillus）、D 魏 斯 氏 菌 屬（Weissella）、E（Enterococcus）、F（Aeribacillus）、G 芽 孢 桿 菌 綱（Bacillus） 、H （Streptophyta） 、I 鮑 特 菌 屬（Bordetella）、J（Achromobacter）、K 叢毛單胞菌屬（Comamonas）、L 蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、M 新根瘤菌屬（Neorhizobium）、N 根瘤菌（Rhizobium）、O固氮螺菌（Azospirillum）、P 腸桿菌（Enterobacter）、Q大腸桿菌志賀菌（Escherichia/Shigella）、R 黑草屬（Buchnera）、S 寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas）、T 不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）。

由圖2 可以看出，樣本中微生物分為4 類，藍(lán)藻/葉綠體（Cyanobacteria/Chloroplast）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteob acteria）和未被分類區(qū)。以界為中心，向外依次為門、綱、目、科、屬和種。圈和星號(hào)的大小代表豐度大小。外圍環(huán)為熱力圖，每一環(huán)為1 個(gè)樣本（組），每個(gè)樣本對(duì)應(yīng)1種顏色。顏色深淺隨物種豐度而變化，物種豐度越大，顏色越深。

本試驗(yàn)濃縮液中微生物群落結(jié)構(gòu)從門水平上分析，優(yōu)勢(shì)菌群為子囊菌門（Ascomycota）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）；從屬水平上分析，濃縮液中的優(yōu)勢(shì)菌群為釀酒酵母屬（Kazachstania）、假絲酵母屬（Candida）和Ogataea、乳 酸 桿 菌 屬 （Lactobacillus） 、鏈 球 菌 屬（Streptococcus）和Aeribacillus。這與趙銘欽等［20]、邱立友等［21]、朱大恒等［22]研究發(fā)現(xiàn)的烤煙煙葉表面微生物種群主要是細(xì)菌、霉菌和放線菌；而霉菌中曲霉（Aspergillus）為優(yōu)勢(shì)菌群的結(jié)果不一致，說(shuō)明烤煙煙葉表面微生物種群的優(yōu)勢(shì)菌群（細(xì)菌）與再造煙葉濃縮液中優(yōu)勢(shì)種群（真菌）差異很大，這可能與再造煙葉濃縮液的生產(chǎn)原料和加工過(guò)程，以及濃縮液的理化性質(zhì)有關(guān)。但再造煙葉濃縮液中優(yōu)勢(shì)種群是如何影響再造煙葉的香味成分仍有待進(jìn)一步研究。

2.2 微生物發(fā)酵對(duì)濃縮液還原糖和總糖含量的影響

微生物發(fā)酵過(guò)程中，碳源對(duì)于微生物生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物積累至關(guān)重要［23]，因此發(fā)酵液中還原糖和總糖含量對(duì)濃縮液發(fā)酵及再造煙葉的生產(chǎn)有重要影響。由表2 可知，濃縮液發(fā)酵前48 h，還原糖和總糖含量緩慢下降；發(fā)酵48～72 h 之間，還原糖和總糖含量迅速下降，說(shuō)明濃縮液中的微生物在發(fā)酵48 h 前消耗的碳源很少，生長(zhǎng)緩慢，屬于遲緩期；48～72 h 之間生長(zhǎng)繁殖較旺盛，需要大量的碳源供應(yīng)，屬于生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期。

表2 微生物發(fā)酵對(duì)濃縮液還原糖和總糖含量的影響①Tab.2 Effects of microbial fermentation on contents of reducing sugar and total sugar in concentrated liquid

2.3 微生物發(fā)酵對(duì)再造煙葉感官品質(zhì)的影響

由感官評(píng)吸結(jié)果（表3）可知，發(fā)酵時(shí)間48 h 和72 h 的濃縮液能夠提高再造煙葉的香氣量和協(xié)調(diào)性，提升舒適度。這可能與濃縮液中微生物在48 h至72 h 之間快速生長(zhǎng)繁殖，發(fā)酵產(chǎn)生一些次級(jí)代謝產(chǎn)物，改變了濃縮液中的某些化學(xué)成分有關(guān)。

表3 再造煙葉評(píng)吸結(jié)果的比較Tab.3 Sensory evaluation results of reconstituted tobacco

3 結(jié)論

造紙法再造煙葉濃縮液微生物的群落結(jié)構(gòu)中主要為真菌種群，含有少量細(xì)菌種群。濃縮液中的真菌占總微生物的80.98%，細(xì)菌占總微生物的19.02%，濃縮液中的真菌含量高于細(xì)菌。真菌種群中的優(yōu)勢(shì)菌屬為釀酒酵母屬（Kazachstania）、假絲酵母屬（Candida）和Ogataea；細(xì)菌種群優(yōu)勢(shì)菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）和Aeribacillus。通過(guò)18S rDNA 序列與16S rDNA 序列的Alpha 多樣性指數(shù)比較，真菌種群的豐富度和多樣性低于細(xì)菌；利用濃縮液微生物在30 ℃條件下振蕩發(fā)酵72 h，可明顯提高再造煙葉的香氣量，改善舒適度。