孫九喆，楊金初，蘇東嬴，王二彬，王君婷，張順峰，李 萌，馬 林*

1. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州市隴海東路72 號 450000

2. 鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道136 號 450001

煙葉品種的真實性是葉組配方穩(wěn)定的基礎(chǔ)，同時也是產(chǎn)品質(zhì)量和風(fēng)格穩(wěn)定的保障。近年來隨著分子標(biāo)記技術(shù)的日益成熟和完善，AFLP、RAPD、SCAR、SSR 和SNP 等分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于煙草指紋圖譜構(gòu)建和品種區(qū)分［1-2]。肖炳光等［3]利用18 條RAPD 引物成功建立29 個烤煙品種的指紋圖譜，為烤煙品種的真實性檢測提供了依據(jù)；馬林等［4]篩選出6 個SCAR 標(biāo)記引物，成功制定出12 個煙草品種的快速鑒定技術(shù)路線；陳婷婷等［5]利用4 對品種鑒別效率高的SSR 引物構(gòu)建了與云煙87 親緣關(guān)系較近的9 個煙草品種指紋圖譜。與其他分子標(biāo)記相比，SSR 具有操作簡單、快速、多態(tài)性高和重復(fù)性好等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于煙草種質(zhì)資源的多樣性分析、分子輔助育種和品種區(qū)分［6-7]。劉國祥等［8]利用25 對SSR 引物對33 個曬煙品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并成功構(gòu)建出33 個曬煙品種指紋圖譜；徐軍等［9]篩選出8 對多態(tài)性較好的SSR 引物，將80 份煙草種質(zhì)完全區(qū)分；黃莉莎等［10]利用已知煙草序列，設(shè)計62 對SSR引物，并篩選出21 對穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的SSR引物用于煙草品種鑒別；尹國英等［11]從278 對SSR引物中篩選出14 對核心引物用于煙草種質(zhì)資源鑒定。但卷煙工業(yè)企業(yè)使用的是烤后煙葉，已報道的煙草品種分子鑒定方法多以鮮煙葉為實驗材料，對烤后煙葉的品種鑒別則鮮見報道［4,12]。而烤后煙葉基因組DNA 降解嚴(yán)重［13]，以鮮煙葉基因組DNA 為基礎(chǔ)構(gòu)建的指紋圖譜可能不適于區(qū)分烤后煙葉品種。此外，目前多應(yīng)用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析SSR 結(jié)果［8-11]，該操作復(fù)雜、耗時且成本較高［14]。為此，以卷煙工業(yè)企業(yè)常用的11 個烤煙品種初烤煙葉為研究材料，選擇產(chǎn)物在200 bp 左右的SSR 引物作為候選引物，應(yīng)用操作簡單的瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，篩選多態(tài)性好、重復(fù)性高的SSR 鑒定引物，構(gòu)建煙草品種指紋圖譜庫，旨在建立基于SSR 的初烤煙葉品種快速鑒別方法，為煙葉收購和煙葉配方選擇等環(huán)節(jié)中區(qū)分煙草品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

以鄭州輕工業(yè)學(xué)院煙草生物技術(shù)研究室保存的卷煙企業(yè)常用的11 個品種初烤煙葉（2017 年生產(chǎn)）為試驗材料，品種信息見表1。

1.1.2 試劑

磁珠法植物基因組DNA 提取試劑盒購自洛陽吉恩特生物科技有限公司；2×Taq Plus Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；24 對SSR 引物選自Bindler 等［15]公布的SSR 遺傳圖譜中多態(tài)性較好的SSR 標(biāo)記（表2），由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表2 24對SSR 引物序列Tab.2 24 SSR primer pairs

1.1.3 儀器

JXSF TPRP-24 組織研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；NanoDrop ND-2000C 超微量分光光度計（美國Thermal Scientific 公司）；DYY-6C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；Vetiti 型梯度PCR儀（美國ABI 公司）；Mini Bis Pro 型凝膠成像分析系統(tǒng)（以色列DNR 凝膠成像系統(tǒng)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取

取15 mg 煙葉置于1.5 mL 離心管中，應(yīng)用組織研磨儀磨成粉末（65 Hz, 2 min），然后采用磁珠法提取煙草基因組DNA，操作過程及試劑用量均按試劑盒說明書進(jìn)行。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計檢測DNA 的質(zhì)量和濃度，將DNA 稀釋至50 ng/μL，置于-20 ℃保存。

1.2.2 SSR-PCR 擴(kuò)增

SSR-PCR 反應(yīng)體系：20 μL 體系，含50 ng/μL模板DNA 2 μL，2×Taq Plus Master Mix 10 μL，10μmol/L 上 、下 游 引 物 各1 μL，ddH2O 補(bǔ) 充 至20μL。SSR-PCR 反 應(yīng) 程 序 ：94 ℃ 預(yù) 變 性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s；35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于3%瓊脂糖凝膠，85 V 恒壓電泳55 min 后應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.3 核心引物篩選及退火溫度優(yōu)化

根據(jù)電泳結(jié)果，對特異性較好的引物進(jìn)行退火溫度優(yōu)化，最終選出特異性強(qiáng)、能產(chǎn)生穩(wěn)定條帶的核心SSR 引物用于初烤后煙葉品種鑒定。

1.2.4 SSR 電泳圖譜分析

根據(jù)標(biāo)記位點每個品種特異性條帶的“有”或“無”對凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行分析?！坝小庇洖椤?”；“無”記為“0”，以構(gòu)建11 個初烤后煙葉品種的指紋譜庫，得到每個煙葉品種的分子ID。根據(jù)分子ID 建立11 個初烤后煙葉品種SSR 鑒定技術(shù)路線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 初烤煙葉基因組DNA 提取結(jié)果

由凝膠電泳結(jié)果（圖1）可知，利用磁珠法提取的基因組DNA 主條帶清晰，無明顯雜帶，膠孔周圍無明顯發(fā)亮物質(zhì)出現(xiàn)；由基因組純度檢測結(jié)果（表3）可知，提取的基因組DNA OD260/OD280的值在1.8 左右，純度較高。因此，利用磁珠法提取的基因組DNA 符合后續(xù)實驗要求。

圖1 煙草基因組DNA 凝膠電泳圖譜Fig.1 Electrophoregram of tobacco genomic DNA

表3 煙草基因組DNA 濃度和純度檢測結(jié)果Tab.3 Test results of concentration and purity of tobacco genomic DNA

2.2 引物篩選及退火溫度優(yōu)化

利用24 對候選SSR 引物分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，均出現(xiàn)清晰條帶，但PT20021、PT1037、PT30021、PT30230、PT30259 和PT40024 引物特異性較弱（圖2），不 適 用 于 品 種 鑒 定 。PT20189、PT40021、PT20306、PT30021、PT30470 和PT20213 等19 對SSR 引物均能產(chǎn)生特異性條帶，可用于品種鑒定。對其進(jìn)行退火溫度優(yōu)化，其中PT20165、PT20172、PT20213、PT30380 和PT40021 等5 對SSR引物能產(chǎn)生穩(wěn)定清晰的特異性條帶，可將供試的11 個初烤后煙草品種完全區(qū)分開（圖3），5 對SSR引物及退火溫度見表4。

2.3 SSR 凝膠電泳圖譜分析

PT20213、PT40021、PT20172、PT30380 和PT20165 在最適退火溫度條件下，分別對11 個供試品種進(jìn)行擴(kuò)增。5 個SSR 引物共擴(kuò)增出15 條穩(wěn)定清晰的特異性譜帶，主要集中在100～300 bp 之間，可通過3%瓊脂糖電泳完全區(qū)分（圖3）。

2.4 煙草品種指紋譜庫的構(gòu)建

根據(jù)PT20213、PT40021、PT20172、PT30380 和PT20165 等5 條引物擴(kuò)增出特異性條帶情況，“0”代表未擴(kuò)增出特異性條帶，“1”代表擴(kuò)增出特異性條帶。利用二元表法對5 張電泳圖進(jìn)行分析，最終建立11 個煙草指紋品種指紋譜庫（表5）和分子ID（表6）。

圖2 6 對特異性較弱SSR 引物的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of six SSR primer pairs with low specificity

表4 5 對核心引物及其退火溫度Tab.4 Five core SSR primer pairs and their annealing temperatures

圖3 5 對特異性SSR 引物的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification results of five specific SSR primer pairs

2.5 煙草品種鑒別路線的建立

根據(jù)11 個煙草品種引物PT20213 的電泳圖譜（圖3），將11 個煙草品種分為4 組。第1 組包含1、7、8、9 號品種；第2 組僅包含10 號品種，即豫煙10號被鑒定出；第3 組包含3 和4 號品種；第4 組包含2、5、6 和11 號品種。

對第1 組而 言，引物PT40021 將第1 組的4 個品種分為兩個亞組，第1 亞組包含1 和9 號品種，第2 亞組包含7 和8 號品種；最后利用引物PT20172 將兩個亞組中的兩個品種區(qū)分開。同理依次類推，第3 組中的兩個品種可用引物PT20172鑒別。第4 組中的4 個品種可通過PT30380 和PT20165 兩輪PCR 完全區(qū)分開。經(jīng)過上述鑒別流程，11 個煙草品種被完全區(qū)分（圖4）。

表5 11 個煙草品種的指紋譜庫Tab.5 Fingerprint spectrum library of 11 tobacco varieties

表6 11 個煙草品種分子IDTab.6 Molecular ID of 11 tobacco varieties

圖4 11 個初烤煙葉品種SSR 鑒定技術(shù)路線Fig.4 Technical route for SSR identification of varieties of 11 cured tobacco leaf samples

3 討論

高質(zhì)量基因組DNA 的獲取是開展分子標(biāo)記研究的基礎(chǔ)，目前煙草基因組DNA 提取方法多為改良CTAB 法［16-18]。本研究中應(yīng)用磁珠法對實驗室保存多年的初烤煙葉樣品進(jìn)行了DNA 提取，該方法不需液氮研磨，提取過程不需要添加酚、氯仿等有機(jī)溶劑，可從15 mg 的煙葉樣品中提取純度和濃度均符合下游實驗需求的基因組DNA，具有簡便、安全、高效等諸多優(yōu)點，可替代CTAB 法用于煙葉基因組提取。

本研究中從24 對SSR 引物中篩選出5 對重復(fù)性和多態(tài)性均較好的鑒定引物，共擴(kuò)增出15 個多態(tài)性位點，平均每個引物3 個，多態(tài)性位點數(shù)量顯著少于前人的研究結(jié)果［9-11]。DNA 模板對PCR 擴(kuò)增結(jié)果有重要影響，以往研究所用模板均為新鮮煙葉基因組DNA，而本研究中PCR 擴(kuò)增所用模板為初烤后煙葉基因組DNA，推測初烤后煙葉基因組DNA 降解和碎片化導(dǎo)致的引物結(jié)合位點的減少可能是造成本研究鑒定引物擴(kuò)增得到多態(tài)性位點較少的重要原因。此外，聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖電泳分析靈敏度的差異也可能是SSR 引物擴(kuò)增位點差異明顯的原因之一［14]。

栽培煙草品種繁多且品種間親緣關(guān)系較近，找到有效鑒定引物是品種區(qū)分的關(guān)鍵。由于初烤后煙葉基因組DNA 與新鮮煙葉差異較大，以新鮮煙葉為實驗材料篩選出的鑒定引物可能不適合區(qū)分烤后煙葉品種。本研究中發(fā)現(xiàn)尹國英等［11]以新鮮煙葉為材料篩選的SSR 核心鑒定引物PT30021、PT30259 和PT40024 在11 個初烤煙葉品種間無多態(tài)性，不能有效區(qū)分煙草品種。本研究中篩選出的5 對SSR 引物可有效區(qū)分包括紅花大金元、云煙85、云煙87 及云煙97 等親緣關(guān)系近的11 個烤煙品種，為煙草企業(yè)提供了一種區(qū)分初烤后煙葉品種的有效方法。在生產(chǎn)實際中隨著鑒別品種范圍的擴(kuò)大，原有鑒定引物可能不能有效區(qū)分新增和原有煙草品種，需要進(jìn)一步篩選加入新的鑒定引物。

4 結(jié)論

以初烤煙葉為研究對象，利用磁珠法提取了卷煙企業(yè)常用的11 個煙草品種基因組DNA。從24 對候選SSR 引物中篩選出5 對穩(wěn)定性高、辨識度好的SSR 引物，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果成功構(gòu)建了11 個核心煙草品種的指紋圖譜，并建立了基于SSR 的11 個煙草品種的快速鑒別方法。本研究中建立的初烤后煙葉品種的鑒別方法具有成本低廉、簡單高效、可操作性強(qiáng)、安全性好等特點，可用于11 個品種初烤煙葉的區(qū)分和品種真實一致性的快速判定。