吳 翔，甘炳成*，唐 亞，譚 昊，黃忠乾，謝麗源，彭衛(wèi)紅，唐 杰，周 潔，陳 影

1. 四川省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所 農(nóng)業(yè)部西南區(qū)域農(nóng)業(yè)微生物資源利用科學觀測實驗站/農(nóng)業(yè)部西南山地農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室，成都市外東獅子山路4 號 610066

2. 四川大學建筑與環(huán)境學院，成都市一環(huán)路南一段24 號 610065

植物根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是指定殖于根系，能直接或間接促進植物生長的微生物［1]。雖然根際促生菌的促生機制尚不明確，但它具有產(chǎn)吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid, IAA）［2-3]、產(chǎn)鐵載體［4-6]、產(chǎn)氰化物［7-10]、溶磷［11-14]及抑制病原菌生長［15-16]的功能。目前，PGPR 的研究主要集中在小麥［7,9]、水稻［17]、玉米［18]等主要糧食作物上，其他作物研究較少。植物生長素IAA 被當作篩選PGPR 的重要指標，根際促生菌通過分泌IAA 來促進植物合成生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，從而促進植物的生長發(fā)育［19-20]。

煙草是我國重要的經(jīng)濟作物，種植廣泛。攀枝花市、宜賓市、瀘州市、涼山州和廣元市是四川省5 大煙草種植區(qū)。目前，四川省煙草主栽區(qū)根際土壤促生菌的研究鮮見報道。為此，從四川省5大煙草種植區(qū)采集煙草根際土壤，從中分離、篩選高效的促生菌，旨在豐富促生菌資源，為煙草促生生物肥料的研發(fā)提供基礎。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集及根際微生物的分離

去除植株根際約5 cm 厚的表層土壤后，采集1 kg 土壤樣品，立即帶回實驗室進行微生物分離。微生物分離采用稀釋平板法［21]，培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1 號和PDA 培養(yǎng)基。對分離到的菌株進行編號，編號規(guī)則：①細菌編號，樣品編號-B-菌株號；②放線菌編號，樣品編號-A-菌株號；③真菌編號，樣品編號-F-菌株編號。每個菌株接種到3 支試管中，4 ℃冰箱保藏，用于功能菌株的篩選。

表1 樣品采集信息Tab.1 Basic sample information

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 L，pH 6.8～7.2。

高氏1號 ：KNO31.00 g，K2HPO40.50 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，NaCl 0.50 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，可溶性淀粉20.00 g，瓊脂20.00 g，蒸餾水1.00 L，pH 7.2～7.4。

PDA 培養(yǎng)基：土豆200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 自然。

1.2 促生微生物IAA 初篩

參照席琳喬等［22]的方法對促生微生物進行IAA 初篩。取50 μL 菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時 加50 μL Salkowski 比色液 。 以 加50 μL IAA（50 mg/L）溶液為陽性對照，以加LB 培養(yǎng)基為陰性對照。菌懸液變紅的程度高于陰性對照則表示微生物能夠產(chǎn)IAA，根據(jù)變紅的程度可初步判斷其產(chǎn)IAA 能力的大小。

Salkowski 比色液：35.0% HClO450.0 mL，0.5 mol/L FeCl31.0 mL。

LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.4。

為把改進成果納入標準化，須把各種設計資料、圖紙整理存檔，納入本單位標準化管理工作中，制定《柱塞總成的操作規(guī)程與維護規(guī)定》，以文件形式下發(fā)到了各班組，并納入檢修規(guī)程中。同時重點要做好以下工作：

1.3 產(chǎn)IAA 能力的檢測

使用UVmini-1240 型分光光度計（日本島津公司）測定不同濃度IAA 溶液在530 nm 處的吸光值，以IAA 濃度為橫坐標，OD530為縱坐標，繪制標準曲線。將初篩菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，4 000 r/min 離心15 min。取4 mL 上清液在530 nm 處進行吸光度測定，并計算IAA 產(chǎn)量，每個菌株重復3 次。標準曲線的制作和菌液中IAA 濃度的測定參照Glickmann 等［23]的方法。標準曲線的空白對照為蒸餾水∶Salkowski 比色液=1∶1 的混合液，菌液檢測的空白對照為LB 液體培養(yǎng)基∶Salkowski 比色液=1∶1 的混合液。

1.4 產(chǎn)鐵載體能力的鑒定

將初篩菌株接種于鐵載體檢測培養(yǎng)基，以不接菌的檢測培養(yǎng)基為空白對照。根據(jù)檢測培養(yǎng)基上菌落周圍是否產(chǎn)鐵載體暈圈判定其是否具有產(chǎn)鐵載體的能力［24]。鐵載體檢測培養(yǎng)基的配置：將無菌的50 mL 0.l mol/L 磷酸緩沖溶液、無菌的50 mL CAS 染液直接加入到1 L 鐵載體檢測基礎培養(yǎng)基中，混勻。

CAS 染液 ：l.0 mmol/L 鉻天青S，0.1 mmol/L FeC13，4.0 mmol/L 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）。

鐵載體檢測基礎培養(yǎng)基：0.5 g KCl，0.5 g MgSO4，4.0 g 葡萄糖，5.0 g 酪蛋白胨，15.0 g 瓊脂，1.0 L 蒸餾水，pH 7.0～7.2。

0.1 mol/L 磷酸緩沖液 ：0.590 5 g NaH2PO4·2H2O，2.427 0 g Na2HPO4·12H2O，0.250 0 g NH4Cl，0.075 0 g KH2PO4，0.125 0 g NaCl，100.00 mL蒸餾水。

1.5 產(chǎn)氰化氫（HCN）能力的鑒定

參 照Lorck［25]的方法檢測菌株產(chǎn)HCN的能力。將初篩菌株接種于添加4.4 g/L 甘氨酸的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上后，再用浸過2%碳酸鈉、0.5%苦味酸溶液（2,4,6-三硝基苯酚）的Whatman1 號濾紙覆蓋，（28±2）℃培養(yǎng)4 d。濾紙顏色由橘黃色轉(zhuǎn)為紅色說明有HCN 產(chǎn)生，根據(jù)轉(zhuǎn)紅的程度判斷菌株產(chǎn)HCN的效果。以不接菌的培養(yǎng)基為空白對照。

1.6 促生菌系的構(gòu)建

將復篩后的促生菌株進行組合，不同組合的菌株接種到裝有LB 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃ 、180 r/min 培 養(yǎng)24 h。利用IAA測定方法（1.3 節(jié)）檢測并計算各組合IAA 的產(chǎn)量，以不接菌的LB 液體培養(yǎng)基為對照，每個組合重復3 次。

1.7 菌株16S rDNA序列的測定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

參照細菌基因組DNA 提取試劑盒（杭州博日科技有限公司）的說明書提取細菌基因組DNA。參照張飛官等［26]的方法擴增菌株16S rDNA。PCR 產(chǎn)物在生工生物工程（上海）有限公司進行測序。將測得的16S rDNA 序列提交到GenBank，獲得各菌株的登錄號。參照張越己等［15]的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.8 種子發(fā)芽試驗

將促生菌株和構(gòu)建的促生菌系分別接入LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h。菌懸液的終濃度為107cfu/mL，以未接菌的LB 液體培養(yǎng)基為空白對照。挑選紅花大金元、MS 云煙85和MS 云煙87（由四川省煙草公司攀枝花市公司米易分公司惠贈）個體飽滿、大小一致的裸種，每個品種20 粒種子，均勻播于鋪有2 層濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，每個品種3次重復。每個培養(yǎng)皿加入4 mL制備好的菌懸液和10-1倍濃度的LB 液體培養(yǎng)基，每種菌液3 次重復，置于人工智能氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：光強70%、光照12 h、溫度25 ℃、相對濕度70%，每隔1 d 補充1 mL 無菌水，以確保種子正常萌發(fā)，于第3、第7 天統(tǒng)計發(fā)芽率。

發(fā)芽率=（發(fā)芽種子數(shù)/檢測種子總數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 根際微生物的分離

從不同地點、不同取樣時間的63 個土壤樣品中，共分離出923 株微生物，其中細菌583 株、放線菌234 株、真菌106 株，基本情況見表2。

表2 樣品微生物的分離情況Tab.2 Microorganism isolation results

2.2 促生菌的篩選

從923 株菌株中，初篩到具有較好產(chǎn)IAA 能力的菌株66 株，包括62 株細菌，占比為93.94%，4 株放線菌，占比為6.06%。通過測定菌株IAA 的產(chǎn)量、是否產(chǎn)鐵載體和HCN 進行復篩。結(jié)果（表3）表明，初篩的66 株菌株IAA 的產(chǎn)量在2.65～42.99 μg/mL 之間，其中菌株L2-001-B-16 產(chǎn)IAA 的能力最強。IAA 產(chǎn)量排前10 的菌株：L2-001-B-16＞MT-002-B-12＞FY-001-B-9＞YBT-003-B-5＞YB-001-B-8＞L2-001-B-14＞L2-002-B-2＞L2-006-B-16＞L2-004-B-2＞SC-118-B-1。對66 株菌株是否具有產(chǎn)鐵載體、HCN 的能力進行檢測發(fā)現(xiàn)，24 株菌株具有產(chǎn)鐵載體能力（表3），11 株菌株具有較好產(chǎn)HCN的能力（表3）。以同時具有較好產(chǎn)IAA、鐵載體和HCN 能力的菌株為復篩菌株，包括L2-001-B-16、MT-002-B-12、FY-001-B-9、YBT-003-B-5、YB-001-B-8。

表3 初篩菌株促生能力的檢測Tab.3 Promoting ability results from first-screening strains

表3（續(xù)）

2.3 促生菌系的構(gòu)建

將5 株復篩菌株進行組合，共31 個組合，測定這些組合產(chǎn)IAA 的能力（表4）。在2 個菌株的組合中，組合45 IAA 的產(chǎn)量最高；在3 個菌株的組合中，組合134 IAA 的產(chǎn)量最高。在31 個組合中，組合1345 產(chǎn)IAA 的能力最高，其IAA 的產(chǎn)量為51.27 μg/mL，極顯著優(yōu)于其他組合。因此，組合1345 為最優(yōu)促生菌系。

表4 促生菌系產(chǎn)IAA 能力的檢測①Tab.4 IAA yields of different growth-promoting rhizobacteria groups

2.4 16S rDNA 序列分析

進一步分析組合1345 的4 株菌株16S rDNA序列。菌株MT-002-B-12、FY-001-B-9 和YBT-003-B-5 的16S rDNA 序列長度分別為1 402、1 354、1 516 bp，在GenBank中的登錄號分別為KT119350、KT119349、KT223830。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育與菌株形態(tài)特征，判定菌株MT-002-B-12 屬于克雷伯氏菌屬的Klebsiella variicola，菌株FY-001-B-9 屬于腸桿菌屬的Enterobacter xiangfangensis，菌 株YBT-003-B-5 屬于芽孢桿菌屬的Bacillus tequilensis。

菌株L2-001-B-16 的16S rDNA 序列長度為1 510 bp。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖1）表明，菌株L2-001-B-16 屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae），與Enterobacter cloacae subsp. Dissolvens 的發(fā)育關(guān)系最近，二者16S rDNA 序列相似性為92.2%；其次是Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae，16S rDNA序列相似性為91.9%；與腸桿菌科其他菌株的相似性均小于91.8%。因此，推測菌株L2-001-B-16 是腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的新類群。

圖1 菌株L2-001-B-16 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain L2-001-B-16 based on 16S rDNA

2.5 對種子萌發(fā)的影響

由表5 可知，與對照相比，不同菌株處理下，3 個煙草品種種子第3 天的發(fā)芽率均極顯著升高。第7 天，菌株YBT-003-B-5 對紅花大金元種子、菌株MT-002-B-12 對MS 云煙87 種子發(fā)芽率的影響均不顯著；其余菌株處理下，3 個煙草品種種子的發(fā)芽率均極顯著升高。第3 天和第7 天，在組合1345 的處理下，3 個煙草品種種子的發(fā)芽率均高于其他菌株，促進煙草種子發(fā)芽的效果明顯。

表5 不同促生菌對煙草種子發(fā)芽率的影響Tab.5 Effects of different growth-promoting rhizobacteria on germinating rates of tobacco seeds

3 討論

席琳喬等［22]從棉花根際土壤中分離到8 株根際促生固氮菌，其IAA 的產(chǎn)量在6.62～22.83 μg/mL之間；劉靜洋［27]篩選到29 株棉花根際細菌，其IAA的產(chǎn)量在0.15～22.87 mg/L 之間；徐明雙［28]發(fā)現(xiàn)31株內(nèi)生菌分泌IAA的產(chǎn)量為1.00～5.49 mg/L；鄭文波等［29]發(fā)現(xiàn)菌株ZH5 IAA的產(chǎn)量為43.18 mg/L。從四川省煙草主栽區(qū)的根際土壤中分離到5 株（YBT-003-B-5、YB-001-B-8、FY-001-B-9、MT-002-B-12、L2-001-B-16）促生菌，所構(gòu)建的促生菌系（MT-002-B-12、L2-001-B-16、FY-001-B-9 和YBT-003-B-5）IAA產(chǎn)量可達51.27 mg/L，高于已報道的促生菌產(chǎn)IAA 的能力［22，27-29]，并且該促生菌系還能顯著提高煙草種子的發(fā)芽率。

促生菌系中的菌株MT-002-B-12、FY-001-B-9和YBT-003-B-5 分 別 屬 于Klebsiella variicola、Enterobacter xiangfangensi 和 Bacillus tequilensis。K. variicola 具有ACC 脫氨酶活性［30]、固氮［31-32]、解鉀［33]等促生功能；E. xiangfangensis 具有產(chǎn)組胺的能力［34]；B. tequilensis 具有促生［35]、產(chǎn)拮抗病原菌活性物質(zhì)的能力［36-37]。但目前還沒有關(guān)于這3 種細菌產(chǎn)IAA、鐵載體和HCN 能力的報道。另外，菌株L2-001-B-16 可能屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的新類群。本研究中，獲得的促生菌株豐富了促生微生物的種類，為利用微生物研制煙草生物肥料提供了更多的選擇。

4 結(jié)論

①從四川省5 個煙草主栽區(qū)的煙草根際土壤中分離到923 株微生物，其中細菌583 株、放線菌234 株、真菌106 株；②初篩篩選到具有較好產(chǎn)IAA能力的菌株66 株，復篩篩選出5 株具有較好產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體和產(chǎn)HCN 能力的菌株；③將菌株MT-002-B-12、L2-001-B-16、FY-001-B-9 和YBT-003-B-5 構(gòu)建成促生菌系，該促生菌系能極顯著促進3個煙草主栽品種種子的萌發(fā)。