肖俊, 胡艷萍, 涂露霞, 魏昕, 陳欽開

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1腎內(nèi)科，2病理科(江西南昌 330006)

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是由法國學(xué)者Berger等[1]首先描述和命名的，其主要特征是以免疫球蛋白IgA為主的免疫復(fù)合物在系膜區(qū)沉積，臨床表現(xiàn)多樣化，其中典型臨床表現(xiàn)為黏膜感染后短暫時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)的肉眼血尿。因此認(rèn)為黏膜免疫異常與IgAN的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。天然黏膜免疫異常可能導(dǎo)致黏膜抗原清除障礙，使得炎癥慢性化并持續(xù)分泌IgA。Toll樣受體4(TLR4)因其在先天性免疫和獲得性免疫中的重要作用越來越受到關(guān)注。近期研究表明TLR4可能通過多種機(jī)制參與IgAN的發(fā)生和進(jìn)展。但TLR4的調(diào)控因素尚不明確。細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)作為一類典型的負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白，對(duì)多種細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起負(fù)反饋調(diào)控作用[2]。生物信息學(xué)軟件提示SOCS3是miR-203的潛在靶基因，miR-203可負(fù)向調(diào)控SOCS3。2014年8月至2016年7月，本研究通過建立IgAN大鼠模型，觀察TLR4、SOCS3及miR-203在腎組織中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，初步探討TLR4、SOCS3、miR-203在IgAN中的作用及三者之間可能的調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只SPF級(jí)雄性SD大鼠均購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體重在150 g左右。標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和IgAN模型組。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 牛血清白蛋白(BSA)、四氯化碳(CCl4)、脂多糖(LPS)均購于美國Sigma公司。SOCS3一抗，TLR4一抗，F(xiàn)ITC-IgA一抗(美國Abcam)，山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(中杉金橋)。Real-timePCR試劑盒(美國Invitrogen)。RM-2135型病理切片機(jī)(德國Leica)，BH-2型雙目光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)，ABI Stepone plus熒光定量PCR儀(美國Thermo)，垂直電泳槽及電泳儀(美國Bio-rad)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 IgAN大鼠模型建立 采用改良的聯(lián)合免疫誘導(dǎo)方法建立實(shí)驗(yàn)性 IgAN大鼠模型，口服牛血清蛋白(BSA)400 mg/kg，隔天1次灌胃，共8周；皮下注射CCl40.1 mL，每周1次，共8周；在第6周末通過尾靜脈注射LPS 0.05 mg；分別在建模第8、9周末收獲大鼠腎臟。正常對(duì)照組則采用同一時(shí)間、等體積的生理鹽水灌胃，皮下注射以及尾靜脈注射。

1.2.2 標(biāo)本的獲取及處理 建模第8、9周末各組分別處死大鼠，通過10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取靠近腎臟皮質(zhì)部分組織，一部分用凍存管保存在-80℃冰箱，一部分放入10%中性甲醛溶液固定后，用石蠟進(jìn)行包埋，留待行PAS染色，一部分新鮮組織用于免疫熒光。

1.2.3 腎組織IgA免疫熒光 大鼠腎組織用OCT包埋劑包埋后，通過低溫切片機(jī)進(jìn)行切片，晾干洗滌滴加FITC標(biāo)記的IgA抗體(1∶50稀釋)，37℃孵育30 min后洗滌，并用甘油封片，通過熒光顯微鏡，觀察熒光亮度及面積。

1.2.4 腎組織PAS染色 10%中性甲醛溶液浸泡的組織通過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片拷片、切片脫蠟、 1%過碘酸水溶液浸泡、 Schiff氏試劑避光孵育、 Mayer 蘇木素復(fù)染2 min、脫水透明封片等步驟，在顯微鏡下觀察系膜細(xì)胞增殖程度。

1.2.5 Western免疫印跡法檢測(cè)腎組織中SOCS3、TLR4的表達(dá) 取出大鼠腎臟組織，稱取大約100 mg組織，用PBS清洗3次后用組織剪剪碎，加入RIPA裂解液。采用組織超聲波裂解組織。通過BCA蛋白定量檢測(cè)蛋白濃度，采用SDS-PAGE凝膠電泳，膠片掃描后使用Image J軟件分析條帶中的灰度值。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腎組織中SOCS3、TLR4、miR-203的表達(dá) 取出大鼠組織，稱取大約100 mg組織，用PBS清洗3次后用組織剪剪碎，放入研缽中，加入1 mL Trizol，并用液氮研磨。根據(jù)Trizol方法步驟提取組織中RNA，采用全式金逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)Invitrogen公司PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量，所有引物設(shè)計(jì)由Invitrogen公司提供。引物序列見表1。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光檢測(cè)兩組腎組織IgA表達(dá)的差別 通過免疫熒光技術(shù)，正常對(duì)照組未見明顯免疫熒光顆粒沉積，IgAN模型組在第8周末系膜區(qū)可見IgA成顆粒狀、團(tuán)塊狀沉積，提示建模成功；第9周末時(shí)熒光強(qiáng)度較第8周末進(jìn)一步增強(qiáng)。見圖1。

2.2 PAS染色觀察兩組大鼠腎臟系膜細(xì)胞增生程度 正常對(duì)照組腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)無明顯增生。IgAN模型組在第8周末時(shí)出現(xiàn)腎小球系膜細(xì)胞輕-中度增生；第9周末時(shí)出現(xiàn)腎小球系膜細(xì)胞中-重度增生。見圖2。

2.3 兩組大鼠腎臟組織SOCS3及TLR4蛋白表達(dá)差異 與正常對(duì)照組相比，IgAN模型組SOCS3及TLR4的蛋白表達(dá)量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IgAN模型組第9周SOCS3蛋白表達(dá)水平較第8周明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而IgAN模型組第8周與第9周TLR4蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表2。

表1 引物序列及大小

A：正常對(duì)照組；B：IgAN模型組第8周；C：IgAN模型組第9周

A：正常對(duì)照組；B：IgAN模型組第8周；C：IgAN模型組第9周

1：正常對(duì)照組；2：IgAN模型組第8周；3：IgAN模型組第9周

2.4 兩組大鼠腎臟組織SOCS3及TLR4基因表達(dá)差異 與正常對(duì)照組相比，IgAN模型組SOCS3及TLR4的mRNA表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IgAN模型組第9周SOCS3的mRNA表達(dá)水平較第8周下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IgAN模型組第8周與第9周TLR4的mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

組別SOCS3/GAPDHTLR4/GAPDH正常對(duì)照組0.33±0.020.27±0.04IgAN模型組8周0.86±0.01?0.74±0.01?IgAN模型組9周0.78±0.05?△0.70±0.03?

*與正常對(duì)照組比較P<0.05；△與IgAN模型組第8周比較P<0.05

2.5 兩組大鼠腎臟組織miR-203的基因表達(dá)量比較 與正常對(duì)照組相比，IgAN模型組miR-203的基因表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IgAN模型組第9周miR-203基因表達(dá)量較第8周增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

組別SOCS3TLR4miR-203正常對(duì)照組1.15±0.211.08±0.160.97±0.04IgAN模型組8周4.61±0.09?4.86±0.40?1.18±0.04?IgAN模型組9周 3.87±0.04?△4.51±0.14? 1.37±0.06?△

*與正常對(duì)照組比較P<0.05；△與IgAN模型組第8周比較P<0.05

3 討論

在以往的研究中，TLR4最突出的生物學(xué)功能是調(diào)控機(jī)體天然免疫及獲得性免疫，在識(shí)別細(xì)菌LPS及介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。由于黏膜免疫異常在IgAN發(fā)病機(jī)制中起重要作用，TLR4在IgAN中的作用日益受到關(guān)注。Coppo等[3]發(fā)現(xiàn)IgAN患者外周單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中TLR4表達(dá)增加，且與尿蛋白及疾病活動(dòng)時(shí)期相關(guān)。Qin等[4]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌LPS激活TLR4可以導(dǎo)致Cosmc的甲基化，從而降低IgA1的糖基化程度。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)IgAN患者PBMC中TLR4表達(dá)量較正常對(duì)照組升高，可能參與IgAN的免疫發(fā)病機(jī)制，同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)IgAN患者腎組織中TLR4表達(dá)也增高，且腎組織TLR4表達(dá)與系膜細(xì)胞增生、間質(zhì)纖維化成正相關(guān)。王纓等[5]發(fā)現(xiàn)IgAN大鼠腎組織中TLR4、髓樣分化因子88(MyD88)、核因子-κB(NF-κB)的表達(dá)增高，TLR4通路可能參與了IgAN的發(fā)生發(fā)展。其他動(dòng)物體內(nèi)研究[6-7]同樣發(fā)現(xiàn)IgAN大鼠腎臟TLR4表達(dá)增高，使用TLR4抑制劑(TAK242)或大黃酸藥物治療后可下調(diào)TLR4的表達(dá)，改善血生化指標(biāo)，減輕腎臟病理損傷?？梢奣LR4信號(hào)通路的激活不僅在IgAN全身免疫紊亂中起作用，也參與了IgA沉積后一系列腎臟局部損傷反應(yīng)。在本研究中，我們也觀察到通過免疫誘導(dǎo)法建立IgAN大鼠模型，在第8周時(shí)腎組織TLR4表達(dá)水平已顯著升高。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)SOCS3在IgAN大鼠腎組織中表達(dá)明顯增高，這與我們前期研究中觀察到SOCS3在IgAN患者腎組織表達(dá)增多的結(jié)果是相一致的。

SOCS3在細(xì)胞因子及免疫抗原誘導(dǎo)的瀑布效應(yīng)中起著非常重要的作用，可以調(diào)控多種細(xì)胞因子及信號(hào)傳導(dǎo)通路，與各種疾病(糖尿病、腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病、過敏性疾病及生殖疾病等)有關(guān)，有可能成為疾病診斷及評(píng)估預(yù)后的分子指標(biāo)，或成為特定疾病的治療靶點(diǎn)[8]。眾多研究表明，SOCS3參與了腎臟病理生理的調(diào)控，包括免疫炎癥反應(yīng)、系膜細(xì)胞增殖、腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及腎纖維化等[9-10]。在糖尿病腎病大鼠模型中，通過上調(diào)SOCS3表達(dá)，可顯著改善腎功能并減少腎臟系膜細(xì)胞增生及間質(zhì)纖維化損傷[11]。但SOCS3在IgAN中的作用鮮見報(bào)道。我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)SOCS3在IgAN患者腎小球、腎小管間質(zhì)中均表達(dá)增高，且SOCS3表達(dá)水平與腎臟病理損害指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)SOCS3可能對(duì)IgAN腎損傷起保護(hù)作用。通過體外實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)SOCS3表達(dá)可抑制IgAN患者aIgA1刺激誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞TLR4的表達(dá)，從而抑制系膜細(xì)胞增殖[12]。

SOCS3對(duì)TLR4信號(hào)通路的調(diào)控作用目前仍有爭議。多數(shù)研究認(rèn)為SOCS3對(duì)TLR4的調(diào)控是負(fù)向調(diào)節(jié)。Hilberath等[13]發(fā)現(xiàn)SOCS3可減輕急性肺損傷中TLR4介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。一項(xiàng)針對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病的研究結(jié)果顯示，上調(diào)SOCS3可以通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路減輕視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[14]。而Liu等[15]則認(rèn)為SOCS3是TLR4信號(hào)通路的正向調(diào)節(jié)子，它是通過反饋抑制TGF-β1/smad3通路而發(fā)揮其正向調(diào)節(jié)作用的。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)隨著IgAN大鼠建模時(shí)間的推移，腎臟系膜細(xì)胞的增生病變加重，腎臟SOCS3的表達(dá)反而呈下降趨勢(shì)，因此我們推測(cè)IgAN早期免疫因素誘導(dǎo)TLR4的表達(dá)增加，繼而啟動(dòng)SOCS3的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，但后期SOCS3表達(dá)下降，未能維持對(duì)免疫炎癥誘發(fā)腎損傷的抑制作用，因而沒有阻止IgAN的進(jìn)程。但抑制SOCS3表達(dá)的機(jī)制尚不明確。

生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)提示SOCS3基因3′UTR存在miR-203結(jié)合位點(diǎn)。許多研究也表明SOCS3是miR-203的靶基因。Ru等[16]發(fā)現(xiàn)沉默miR-203可上調(diào)乳腺腫瘤細(xì)胞SOCS3的表達(dá)。Navarro等[17]在原發(fā)性血小板減少癥患者中發(fā)現(xiàn)miR-203與其靶基因SOCS3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)IgAN大鼠腎組織中miR-203表達(dá)增加，隨著建模時(shí)間延長miR-203進(jìn)一步升高，正好與SOCS3變化相反，由此我們推測(cè)miR-203表達(dá)的持續(xù)增高，可能負(fù)調(diào)控SOCS3水平，抑制了SOCS3對(duì)腎臟的保護(hù)作用，使得TLR4介導(dǎo)的腎臟炎癥反應(yīng)及系膜細(xì)胞增生病變加重。

通過本研究，我們證實(shí)了TLR4在IgAN發(fā)生發(fā)展中的促進(jìn)作用，初步揭示了SOCS3對(duì)IgAN腎損傷的保護(hù)作用，以及miR-203對(duì)SOCS3可能的調(diào)控作用。當(dāng)然三者在IgAN中的確切作用及三者間的相互關(guān)系仍有待更深入的研究證實(shí)。以SOCS3為靶點(diǎn)，尋求上調(diào)其表達(dá)的途徑，以抑制炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖等病理損害，將為IgAN的治療提供新的方向。