黃思瑞，匡梅娜，袁茵△，魯欣，陳丹亮

1廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院(廣東廣州 510006)； 2華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(廣東廣州 510631)； 3暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科(廣東廣州 510630)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有豐富多樣的生物功能，是組織工程、移植免疫、基因治療等領(lǐng)域的重要種子細(xì)胞[1]，有著廣闊的應(yīng)用前景。MSCs可從骨髓、脂肪、乳牙以及新生兒的臍帶、胎盤等組織中分離[2]。其中，臍帶因取材方便、無倫理學(xué)爭議等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是MSCs的一個(gè)理想來源[3]。人臍帶MSCs(human umbilical cord MSCs，hUC-MSCs)主要存在于臍帶的華通氏膠及臍靜脈內(nèi)皮下層，可通過酶消化法[4]和組織塊(貼壁)法[5]獲得。組織塊法操作簡便、成功率高、成本低，所得hUC-MSCs的數(shù)量、細(xì)胞活力、分化潛力均優(yōu)于酶消化法[6-7],其常規(guī)操作是將臍帶剪碎成組織小塊后直接鋪板培養(yǎng)，從中獲得一批hUC-MSCs后便將組織塊、組織塊培養(yǎng)上清等丟棄，對標(biāo)本的利用度低且分離周期較長。有研究回收并再次培養(yǎng)了已利用過一次的臍帶組織塊，發(fā)現(xiàn)仍可從中獲得典型的hUC-MSCs[8-9]，這提示離體培養(yǎng)的臍帶組織具有反復(fù)多次產(chǎn)出MSCs的潛力，但較少有報(bào)道涉及對更多次數(shù)的臍帶組織塊反復(fù)培養(yǎng)的研究。此外，有關(guān)原代培養(yǎng)體系的其他副產(chǎn)物(如組織塊培養(yǎng)上清)的潛在利用價(jià)值、以及優(yōu)化組織塊處理方法的報(bào)道亦不多見。2017年7月至2018年2月，本研究針對上述問題進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，建立了一種更為高效的相同供體來源hUC-MSCs的多批次原代分離方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臍帶標(biāo)本 健康足月新生兒臍帶由暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科提供，產(chǎn)婦無傳染性疾病，產(chǎn)婦本人及家屬知情同意。

1.1.2 主要試劑與儀器 DMEM/F12培養(yǎng)液、TrypLE Express胰酶、青/鏈霉素溶液(美國Gibco公司)；胎牛血清(FBS；浙江天杭生物科技有限公司)；hUC-MSCs成脂和成骨誘導(dǎo)分化試劑盒(賽業(yè)生物科技有限公司)；細(xì)胞周期檢測試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；PE標(biāo)記小鼠抗人CD45、PE/Cy5標(biāo)記小鼠抗人CD34流式抗體(美國Beckman Coulter公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記小鼠抗人CD73、FITC標(biāo)記小鼠抗人CD90、PE標(biāo)記小鼠抗人CD105流式抗體(美國eBioscience公司)；MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；BDS200倒置顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 臍帶組織塊初培養(yǎng) 將新鮮采集的臍帶浸泡于含1%青/鏈霉素的HBSS緩沖液中。在超凈臺(tái)中，測量臍帶長度，再將臍帶剪成若干個(gè)2 cm長的小段，在HBSS緩沖液中進(jìn)行充分洗滌，去除殘留臍帶血。取每個(gè)臍帶小段，剝離內(nèi)部的3條血管，保留除血管外的臍帶組織。將臍帶組織剪碎成2～3 mm3的組織小塊，按0.5 mL/cm臍帶的量加入FBS浸泡臍帶組織塊30 min(FBS浸泡組)，同時(shí)設(shè)未用血清浸泡的對照組。將組織塊分組均勻接種到6孔板中，每孔放置5塊，放超凈臺(tái)內(nèi)無菌風(fēng)干至組織塊邊緣微干涸。倒扣培養(yǎng)板，在37℃的CO2培養(yǎng)箱(5%CO2、飽和濕度)內(nèi)放置培養(yǎng)6 h后，將培養(yǎng)板翻正，向每個(gè)板孔中緩慢加入2 mL DMEM/F12完全培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS、1%青/鏈霉素)，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。絕對靜置7 d，之后每3 d全量換液并在倒置顯微鏡下觀察組織塊周邊貼壁細(xì)胞的爬出情況。記錄各組的原代細(xì)胞最早出現(xiàn)時(shí)間，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算組織塊培養(yǎng)成功率(成功游離出細(xì)胞的組織塊個(gè)數(shù)/接種的組織塊總個(gè)數(shù)×100%)。

1.2.2 臍帶組織塊轉(zhuǎn)板和培養(yǎng)上清回收 當(dāng)鏡下可見從組織塊游離出的貼壁細(xì)胞生長至80%～90%融合時(shí)，對初(或前一批)培養(yǎng)體系中的臍帶組織塊和培養(yǎng)上清進(jìn)行回收再處理：在超凈臺(tái)內(nèi)，打開6孔板，用彎頭眼科鑷將板孔中的臍帶組織塊逐一夾離培養(yǎng)板底部，所有組織塊在FBS中浸泡30 min，鋪板、培養(yǎng)、觀察等操作同1.2.1。同一供體來源的臍帶組織塊共回收利用2次，總計(jì)3批次原代分離培養(yǎng)，依次記為：組織塊初培養(yǎng)組、組織塊第2次培養(yǎng)組、組織塊第3次培養(yǎng)組；移出組織塊后，收集組織塊初培養(yǎng)組和組織塊第2次培養(yǎng)組的培養(yǎng)上清，分別記為：上清1組和上清2組，轉(zhuǎn)移到T 25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(6～8 mL/瓶)，置37℃的CO2培養(yǎng)箱(5%CO2、飽和濕度)內(nèi)孵育，每天在倒置顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞的出現(xiàn)、增多情況。

1.2.3 原代細(xì)胞傳代 當(dāng)原代細(xì)胞貼壁生長至80%～90%融合時(shí)，即進(jìn)行首次傳代。對于組織塊培養(yǎng)體系，先按1.2.2回收組織塊和培養(yǎng)上清，再消化細(xì)胞；對于不含組織塊的原培養(yǎng)上清孵育體系，直接棄上清后進(jìn)行細(xì)胞消化。具體過程為：用PBS緩沖液洗滌貼壁細(xì)胞1次，然后加入1～2 mL TrypLE Express胰酶，37℃溫和消化原代貼壁細(xì)胞，待全部細(xì)胞脫壁后，加入血清終止消化，收集所有細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，記錄P1代細(xì)胞數(shù)(每厘米臍帶分離得到的細(xì)胞數(shù))和第1次傳代時(shí)間。

1.2.4 細(xì)胞增殖能力檢測

1.2.4.1 生長曲線測定 采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定各批次hUC-MSCs 的生長曲線。取各批次分離得到的P4代細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，按2×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板，每孔200 μL，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24 h計(jì)數(shù)1次，每次取4個(gè)復(fù)孔，消化、收集每孔內(nèi)的所有細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d。以培養(yǎng)時(shí)間(d)為橫軸、細(xì)胞數(shù)為縱軸繪制生長曲線。

1.2.4.2 細(xì)胞周期檢測 取P4代處于對數(shù)生長期的各批次hUC-MSCs，胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次后加入70%冷乙醇，輕輕吹打混勻，4℃固定過夜，加入PBS洗滌1次，最后用0.5 mL碘化丙啶染色液于37℃溫浴避光染色30 min，上流式細(xì)胞儀檢測，使用ModFit軟件分析處理結(jié)果。

1.2.5 免疫表型檢測 消化收集P4代各批次細(xì)胞，制成1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌1次，分裝至流式檢測管，每管100 μL，分別加入下列CD分子的熒光標(biāo)記抗體：CD73-FITC、CD90-FITC、CD105-PE、CD34-PE/Cy5、CD45-PE，同時(shí)設(shè)同型對照以及不加任何抗體的陰性對照。室溫避光孵育30 min，每管加入3 mL流式洗滌液離心洗滌細(xì)胞2次，最后加入500 μL PBS重懸細(xì)胞。上流式細(xì)胞儀檢測，使用FlowJo軟件處理結(jié)果。

1.2.6 成脂和成骨分化能力檢測 消化收集各批次細(xì)胞，按2×104個(gè)/孔接種到6孔板內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到90%匯合時(shí)，更換成脂或成骨分化誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2次。誘導(dǎo)2～3周后，吸走誘導(dǎo)液，加入4%中性甲醛固定30 min，分別加入油紅O染色液或茜素紅染色液進(jìn)行染色，于倒置顯微鏡下觀察各批次細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后的染色情況。

2 結(jié)果

2.1 血清浸泡對臍帶組織塊初培養(yǎng)體系中原代細(xì)胞分離效率的影響 鋪板培養(yǎng)前用FBS浸泡臍帶組織塊，能顯著縮短原代細(xì)胞的最早出現(xiàn)時(shí)間和收獲時(shí)間，提高組織塊的培養(yǎng)成功率，并增加原代細(xì)胞產(chǎn)量。據(jù)此，后續(xù)多批次培養(yǎng)均采用相同的血清浸泡前處理方案。見表1。

組別原代細(xì)胞最早出現(xiàn)時(shí)間(d)第1次傳代時(shí)間(d)組織塊培養(yǎng)成功率(%)P1代細(xì)胞數(shù)(×104/cm)對照組16.50±2.6521.5±2.3848.3±6.361.66±0.18FBS浸泡組 8.50±1.29? 12.8±1.96? 86.7±5.43?6.03±0.34??

與對照組比較*P<0.01，**P<0.001

2.2 各批次相同供體hUC-MSCs的分離時(shí)間和產(chǎn)量 在分離效率方面，與組織塊初培養(yǎng)組比較，回收的臍帶組織塊和培養(yǎng)上清均可在較短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)量更多的原代細(xì)胞，見表2。同一供體的臍帶組織塊通過3次貼壁培養(yǎng)以及2次培養(yǎng)上清回收孵育，可獲得的P1代hUC-MSCs的總數(shù)為(45.10±2.04)×105個(gè)/cm，是臍帶組織塊一次性培養(yǎng)細(xì)胞收獲量的(27.48±3.98)倍(組織塊未經(jīng)血清浸泡處理)或(7.49±0.30)倍(組織塊預(yù)先用血清浸泡處理)。

組別原代細(xì)胞最早出現(xiàn)時(shí)間(d)第1次傳代時(shí)間(d)P1代細(xì)胞數(shù)(×104/cm)組織塊初培養(yǎng)組8.50±1.2912.80±0.96 6.03±0.34組織塊第2次培養(yǎng)組2.25±0.50?7.00±0.82??10.40±0.58??上清1組3.00±0.82??8.00±0.82?9.15±0.97?組織塊第3次培養(yǎng)組2.75±0.96?7.25±0.96?10.30±0.61??上清2組3.00±1.15??8.00±1.15??9.31±0.80?

與組織塊初培養(yǎng)組比較*P<0.05，**P<0.01

2.3 各批次相同供體hUC-MSCs的原代分離形態(tài) 初次貼壁培養(yǎng)時(shí)，接種1～2周后，在倒置顯微鏡下可見梭形、短桿狀的貼壁細(xì)胞從黃褐色臍帶組織小塊的邊緣爬出，見圖1-A。而在進(jìn)行多批次重復(fù)培養(yǎng)時(shí)，回收的組織塊及培養(yǎng)上清在1周內(nèi)即可獲得生長至80%匯合的貼壁細(xì)胞，見圖1-B、C、D、E。各批次臍帶來源的細(xì)胞均呈現(xiàn)典型的MSCs形態(tài)特征：單個(gè)的細(xì)胞為成纖維狀，折光性強(qiáng)，胞質(zhì)豐富，極性分布；細(xì)胞匯合時(shí)呈平行排列，漩渦狀生長。

2.4 各批次相同供體hUC-MSCs的增殖能力

2.4.1 細(xì)胞生長曲線 各批hUC-MSCs的生長曲線形態(tài)相似：第1～2 天細(xì)胞處于潛伏期，增殖不明顯；第3～5天細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞增殖加速；第6天之后進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞生長停滯,見圖2。

2.4.2 細(xì)胞周期 各批hUC-MSCs的細(xì)胞周期分布相似，G0/G1期或(S+G2/M)期細(xì)胞比例差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3和表3。

組別G0/G1S+G2/M組織塊初培養(yǎng)組74.49±2.5025.26±2.41組織塊第2次培養(yǎng)組76.00±1.8524.02±1.85上清1組75.40±1.4224.60±1.42組織塊第3次培養(yǎng)組75.77±1.6824.23±1.68上清2組76.85±1.2323.40±1.04

2.5 各批次相同供體hUC-MSCs的免疫表型 各批人臍帶來源的細(xì)胞均一地表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的表面標(biāo)記CD73、CD90、CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記CD34和人類白細(xì)胞共同抗原CD45，符合MSCs的表型特征，見圖4。

2.6 各批次相同供體hUC-MSCs的分化能力

2.6.1 成脂分化能力檢測 加入成脂分化誘導(dǎo)液后，各批次hUC-MSCs的細(xì)胞生長幾乎停止，72 h后胞質(zhì)內(nèi)有小脂滴出現(xiàn)并逐漸增多、相互融合，細(xì)胞由梭狀變?yōu)閳A形或橢圓形，部分細(xì)胞核偏位。連續(xù)誘導(dǎo)2～3周后，油紅O染色顯示各組細(xì)胞內(nèi)均有大量脂質(zhì)沉淀，見圖5。

2.6.2 成骨分化能力檢測 在成骨定向誘導(dǎo)分化的過程中，細(xì)胞的體積逐漸增大，由纖維狀向短梭狀、鱗片狀、多角形等形態(tài)轉(zhuǎn)變，胞質(zhì)內(nèi)顆粒物質(zhì)逐漸增多，細(xì)胞形成短突起彼此相連，呈集落樣生長，具有典型的成骨細(xì)胞形態(tài)。到了成骨誘導(dǎo)后期，細(xì)胞結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞逐漸融合而失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間可見鈣質(zhì)沉積，各組經(jīng)茜素紅染色后均呈紅色。見圖6。

A：組織塊初培養(yǎng)組，培養(yǎng)第13天；B：組織塊第2次培養(yǎng)組，培養(yǎng)第7天；C：上清1組，培養(yǎng)第7天；D：組織塊第3次培養(yǎng)組，培養(yǎng)第7天；E：上清2組，培養(yǎng)第7天。褐色不透光部分為臍帶組織塊

圖1各批次原代hUC-MSCs的光鏡形態(tài)(×100)

圖2各批次相同供體hUC-MSCs的生長曲線

A：組織塊初培養(yǎng)組；B：組織塊第2次培養(yǎng)組；C：上清1組；D：組織塊第3次培養(yǎng)組；E：上清2組

圖3各批次相同供體hUC-MSCs的細(xì)胞周期分布

3 討論

hUC-MSCs是MSCs家族的新生代表。與成人組織來源的MSCs相比，hUC-MSCs的組織來源更為原始，具有生物性能穩(wěn)定、增殖活性高、分化潛力大、免疫原性低、免疫調(diào)節(jié)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[10]。此外，從作為常規(guī)醫(yī)療廢棄物的臍帶中分離MSCs不存在倫理爭議，避免了使用胚胎干細(xì)胞和骨髓MSCs的諸多限制，更適宜于細(xì)胞治療。然而，臨床治療所需的種子細(xì)胞數(shù)量巨大，因此建立高效、穩(wěn)定的hUC-MSCs分離體系尤為重要。

目前通常采用酶消化法或組織塊(貼壁)法分離hUC-MSCs。酶消化法使用膠原酶、胰酶等對臍帶組織進(jìn)行消化，以從中獲取hUC-MSCs，但由于酶解時(shí)間不易控制，因此分離效果不穩(wěn)定且極易損傷細(xì)胞[11]。組織塊法分離成本低、簡便易行、成功率高、重現(xiàn)性好，但細(xì)胞分離周期過長，綜合現(xiàn)有報(bào)道和本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，從臍帶組織塊接種培養(yǎng)到能夠進(jìn)行細(xì)胞首次傳代的時(shí)間一般在20 d左右[12-13]?？梢?，無論采用目前常用的任何一種技術(shù)方案來分離hUC-MSCs，臍帶標(biāo)本的利用度、原代細(xì)胞的分離效率及數(shù)量或質(zhì)量均不理想。

值得注意的是，現(xiàn)有的hUC-MSCs分離方法在使用新鮮臍帶組織獲得了一批hUC-MSCs后，即將臍帶組織作為廢物丟棄。但我們認(rèn)為，受培養(yǎng)器皿所固有的培養(yǎng)面積、培養(yǎng)基、酶消化效率等因素所限，僅經(jīng)一次離體培養(yǎng)，臍帶組織中所富含的MSCs可能并未被充分、徹底地分離出來。已經(jīng)有報(bào)道指出[8-9]，臍帶組織塊經(jīng)過第2次貼壁培養(yǎng)，能夠在較短時(shí)間內(nèi)游離出干細(xì)胞并形成細(xì)胞克隆，這些細(xì)胞同樣具有MSCs的生物學(xué)特性,且細(xì)胞數(shù)量有一定程度增加。而本研究則在現(xiàn)有組織塊貼壁法以及上述研究的基礎(chǔ)上，先將臍帶組織塊用FBS浸泡處理，再進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，并且將培養(yǎng)次數(shù)提高到了3次。由于臍帶組織塊在經(jīng)過一輪離體培養(yǎng)和釋放出一批hUC-MSCs后，對體外培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)度提高，其結(jié)構(gòu)與剛離體時(shí)相比更加松解，華通膠更為暴露，因此當(dāng)對其進(jìn)行第2、3次貼壁培養(yǎng)時(shí)，第2天即可從中游離出細(xì)胞，7 d左右可長滿傳代，這與之前的報(bào)道基本一致。

圖4 各批次相同供體hUC-MSCs免疫表型的流式檢測

不僅如此，我們還發(fā)現(xiàn)，臍帶組織塊的培養(yǎng)上清在被回收和單獨(dú)孵育后，也能夠快速地從中獲得一定數(shù)量的hUC-MSCs。這說明經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，已經(jīng)有一部分細(xì)胞從組織塊直接釋放到了培養(yǎng)上清中，呈散在懸浮狀態(tài)存在[14]；而已形成克隆的原代貼壁細(xì)胞可能會(huì)分泌生長因子等到培養(yǎng)上清中，促進(jìn)同處其中的上述懸浮細(xì)胞的貼壁和增殖[15]。通過臍帶組織塊本身及其培養(yǎng)上清的多次循環(huán)利用，每份臍帶標(biāo)本的P1代hUC-MSCs總產(chǎn)量可達(dá)到(45.10±2.04)×105個(gè)/cm，平均為傳統(tǒng)單次貼壁法細(xì)胞收獲量的27.48倍，與現(xiàn)有報(bào)道[13]的細(xì)胞產(chǎn)量相比有大幅提高。

另外，本研究確認(rèn)，鋪板培養(yǎng)前用FBS浸泡臍帶組織塊，能顯著縮短原代細(xì)胞的最早出現(xiàn)時(shí)間、提高組織塊的培養(yǎng)成功率，這在臍帶組織塊初次培養(yǎng)時(shí)尤為明顯。但使用異種血清處理或培養(yǎng)人源MSCs，會(huì)將異源動(dòng)物蛋白(免疫原或病原)引入細(xì)胞制品，影響MSCs的臨床應(yīng)用[16-17]?？蛇M(jìn)一步探討用人源血清代替FBS浸泡處理以及培養(yǎng)臍帶組織塊的可行性，以便為臨床治療級(jí)別MSCs制品的高效制備打下基礎(chǔ)。

A：組織塊初培養(yǎng)組；B：組織塊第2次培養(yǎng)組；C：上清1組；D：組織塊第3次培養(yǎng)組；E：上清2組

圖5各批次hUC-MSCs的成脂分化能力鑒定(×100)

A：組織塊初培養(yǎng)組；B：組織塊第2次培養(yǎng)組；C：上清1組；D：組織塊第3次培養(yǎng)組；E：上清2組

圖6各批次hUC-MSCs的成骨分化能力鑒定(×100)

綜上所述，本研究對利用組織塊貼壁法分離hUC-MSCs的現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行了較大的改進(jìn)，建立了一種相同供體hUC-MSCs的多批次原代分離技術(shù)，通過血清包被、組織塊“轉(zhuǎn)板”連續(xù)培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)上清再利用等環(huán)節(jié)的操作，極大地提高了原代hUC-MSCs的產(chǎn)量和臍帶標(biāo)本的利用度，能夠在較短時(shí)間內(nèi)為相關(guān)研究提供充足且優(yōu)質(zhì)的相同供體來源hUC-MSCs。