孫紅煒，張永鑫，徐曉輝，高 瑞，李 凡，楊淑珂，路興波

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轉基因玉米雙抗12-5對根際土壤酶活性及微生物多樣性的影響①

孫紅煒，張永鑫，徐曉輝，高 瑞，李 凡，楊淑珂，路興波*

(山東省農業(yè)科學院植物保護研究所/山東省植物病毒學重點實驗室，濟南 250100)

采用田間試驗研究了轉基因玉米瑞豐1號-雙抗-12-5(RF1-12-5)種植對根際土壤酶活性、微生物群落的影響，可為RF1-12-5的環(huán)境釋放和商業(yè)化應用提供科學的安全性評價數據支持。研究結果表明：①在5個生育期內，RF1-12-5與其非轉基因對照品種瑞豐1號(RF1)根際土壤堿性蛋白酶、脲酶和酸性轉化酶活性均沒有顯著性差異；RF1-12-5根際土壤過氧化氫酶活性在收獲期、堿性磷酸酶活性在乳熟期顯著低于RF1，其他生育期差異不顯著。②在5個生育期內，RF1-12-5與RF1根際土壤微生物群落的Shannon多樣性指數、McIntosh均勻度指數和Simpson優(yōu)勢度指數均不存在顯著性差異，主成分分析未發(fā)現RF1-12-5與RF1根際微生物功能多樣性存在規(guī)律性差異。

轉基因玉米；根際土壤；酶活性；微生物多樣性；Biolog；主成分分析

2016年，在轉基因商業(yè)化種植的第21年，有26 個國家種植了1.851 億hm2轉基因作物，比2015年增長了540萬hm2[1-2]。蘇云金芽孢桿菌(Bt)由日本科學家Shigetane Ishiwatari于1901年發(fā)現[3]，1911年，Ernst Berliner從患病的地中海粉斑螟()幼蟲中分離得到也能產這種伴孢晶體的芽孢桿菌，并命名為蘇云金芽孢桿菌()[4]。Bt 毒素通過蛋白水解活化，導致細胞膜產生孔隙，造成溶質流出腸上皮細胞而使水流入細胞，進而造成昆蟲死亡[5-7]。浙江大學研發(fā)的玉米品種瑞豐1號–雙抗-12-5(RF1-12-5)含有抗蟲基因和耐除草劑基因、，表達的Bt蛋白不僅能有效殺滅亞洲玉米螟，在一定程度上還可以降低其他鱗翅目害蟲的危害。

起初Bt蛋白被直接作為殺蟲劑使用，隨著轉基因技術發(fā)展，基因在生物育種領域得到廣泛應用。2001年，表達Cry1F蛋白的玉米品種由美國人Pioneer和Dow共同研發(fā)成功。2016年，全球轉基因玉米的應用率為 26%，其中美國種植了3 505萬hm2，應用率達到了92%[1]。從2006年開始，為了滿足消費者多樣化的需求，復合性狀轉基因作物得到研發(fā)并開始大規(guī)模種植[8-9]。2016年，復合性狀轉基因作物占全球轉基因作物種植面積的 41%[2]。復合性狀產品在抗蟲、抗除草劑、抗旱、抗?jié)场⒖果}以及營養(yǎng)性狀改良等多方向的性狀改良呈加速發(fā)展的態(tài)勢。

土壤酶活性及土壤微生物直接影響土壤生化過程的效率[10]，影響土壤發(fā)育與成熟的過程，是評價土壤狀況的重要因素。而RF1-12-5的應用又可以大量減少化學農藥的使用，提高玉米產量。目前，關于轉基因玉米對土壤微生物及酶活性的研究時有報道[11-13]，但許多都限于溫室盆栽試驗。本研究選擇在大田進行試驗，可以更確切地探究現實農業(yè)生產中的情況，通過測定RF1-12-5對根際土壤微生物和酶活性的影響，可以為RF1-12-5的環(huán)境釋放提供科學的數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試轉基因抗蟲耐除草劑玉米品種瑞豐1號-雙抗-12-5(簡稱RF1-12-5)由浙江大學提供，其非轉基因對照為瑞豐1號(簡稱RF1)。試驗在農業(yè)部轉基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗檢測中心(濟南)的實驗田進行，土壤為褐土。5種土壤酶測定試劑盒購自蘇州科銘生物技術有限公司，ECO PlateTM96孔板(31種碳源)購自Biolog公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 試驗設置RF1-12-5、RF1種植及未種植玉米的空白對照3個處理，每個處理3次重復[14]，小區(qū)面積為30 m×5 m，小區(qū)隨機分布，小區(qū)間設置1 m隔離帶。按常規(guī)管理模式進行管理。每個小區(qū)將1株玉米作為1個取樣點，進行對角線5點取樣，仔細收集根際土壤，5點合為1個樣品混勻。分別在玉米6 ~ 8葉期、大喇叭口期、抽雄期、乳熟期、收獲期進行取樣。土壤樣品取回后自然風干，去除碎石塊、雜草、碎磚塊及秸稈等雜物，搗碎，混勻，過20目篩，–80℃凍存，待測。

1.2.2 酶活性測定 土壤堿性蛋白酶、過氧化氫酶、堿性磷酸酶、脲酶和酸性轉化酶均通過水解底物產生顏色變化，使用比色法進行活性測定[15]。以1 d內1 g土壤產生1 mg酪氨酸為1個土壤堿性蛋白酶活力單位；以1 d內1 g風干土樣催化1 μmol過氧化氫作為1個過氧化氫酶活力單位；以1 g土壤1 d釋放1 nmol酚為1個土壤堿性磷酸酶活力單位；以1 d中1 g土樣中產生1 μg NH3-N作為一個酶活力單位；以1 d內1 g土樣中產生1 mg還原糖作為一個土壤酸性轉化酶活性單位。

1.2.3 根際土壤微生物多樣性測定 采用Biolog法測定根際土壤微生物多樣性。稱取25 g土壤樣品于500 ml錐形瓶中，加入滅菌生理鹽水稀釋到250 ml (為10–1稀釋)，搖床200 r/min搖動20 min，室溫沉降30 min，加入滅菌生理鹽水稀釋到10–3。將稀釋后菌懸液加入ECO板微孔中，每孔150 μl。然后將ECO板放入25℃培養(yǎng)箱，放置水盒，確保培養(yǎng)箱的飽和濕度。每隔24 h對ECO板用Biolog Microstation在590 nm和750 nm下進行讀數，共進行7次[16]。使用Microlog軟件進行數據轉化，使用Excel軟件制作公式，進行Shannon多樣性指數、McIntosh均勻度指數、Simpson優(yōu)勢度指數的計算，公式如表1所示[17-18]。使用DPS軟件進行各項指數的差異顯著性分析，使用SPSS軟件進行主成分分析[19]。

表1 微生物群落多樣性指數功能與計算公式

2 結果與分析

2.1 RF1-12-5對根際土壤酶活性的影響

由圖1A看出，前4個生育期，RF1-12-5、RF1、對照3個處理根際土壤堿性蛋白酶活性均呈現無規(guī)律性地增減，但增減幅度較小，酶活性在0 ~ 20 mg/(d·g) 變動；收獲期，3個處理堿性蛋白酶活性激增，達到100 mg/(d·g)以上。從方差分析結果看，在5個時期，RF1-12-5與RF1處理根際土壤堿性蛋白酶活性均沒有顯著性差異；在大喇叭口期，RF1-12-5與RF1處理根際土壤堿性蛋白酶活性顯著高于對照；乳熟期，RF1-12-5處理顯著低于對照。

由圖1B看出，在5個生育期，RF1-12-5、RF1處理及對照根際土壤過氧化氫酶活性均呈現無規(guī)律波動狀態(tài)。在前4個時期，RF1-2-5與RF1處理根際土壤過氧化氫酶活性差異均不顯著，在大喇叭口和乳熟期，RF1-12-5、RF1處理根際土壤過氧化氫酶活性顯著高于與對照；在收獲期，RF1-12-5根際土壤過氧化氫酶活性低于RF1處理和對照，且差異顯著。

由圖1C看出，玉米種植處理根際土壤堿性磷酸酶活性在多個生育期均高于對照，說明玉米種植對該酶變化有一定影響。RF1-12-5處理酶活性在前4個時期比較穩(wěn)定，乳熟期RF1處理酶活性增加明顯，收獲期3個處理酶活性下降至整個生育期最低。經檢驗，除了乳熟期RF1-12-5與RF1處理差異顯著外，其他時期RF1-12-5與RF1處理根際土壤堿性磷酸酶活性差異不顯著。

由圖1D看出，根際土壤脲酶活性在前3個時期呈現較為穩(wěn)定的狀態(tài)，酶活性較高；乳熟期及收獲期酶活性明顯下降，且這2個時期酶活性變化不大。經檢驗，5個時期RF1-12-5與RF1處理根際土壤脲酶活性差異均不顯著；除6 ~ 8葉期外，其他時期二者脲酶活性均高于對照，差異顯著。

由圖1E看出，在5個生育期，RF1-12-5與RF1處理根際土壤酸性轉化酶活性比較穩(wěn)定，波動幅度不大；對照土壤中酸性轉化酶活性在6 ~ 8葉期最高，之后呈現下降、上升再下降的波動。經檢驗，5個時期RF1-12-5與RF1處理根際土壤酸性轉化酶活性均沒有顯著性差異；僅在抽雄期，RF1-12-5處理玉米根際土壤酸性轉化酶活性顯著高于對照。

(圖中不同小寫字母表示同–生育期不同處理間差異在P<0.05水平顯著，下同)

2.2 RF1-12-5對根際土壤微生物功能多樣性的影響

Shannon多樣性指數能夠指示一個地區(qū)種群的豐富度。從圖2A可以看出，整個生育期3個處理根際土壤微生物Shannon指數波動幅度較小。在5個時期，RF1-12-5與RF1處理Shannon指數均沒有顯著性差異；在大喇叭口期、抽雄期和收獲期，RF1-12-5與RF1處理Shannon指數顯著高于未種植玉米對照。

McIntosh均勻度指數能夠評價群落內部物種數量的均勻程度。由圖2B可以看出，3個處理不同生育期根際土壤McIntosh指數波動較大。在6 ~ 8葉期，3種處理McIntosh指數相當；至大喇叭口期和抽雄期，RF1-12-5與RF1處理McIntosh指數變化不大，而對照McIntosh指數大幅降低，與其他兩種處理差異顯著；至乳熟期，RF1-12-5與RF1處理McIntosh指數降低，而對照大幅增加，與RF1-12-5與RF1處理差異顯著；至收獲期，RF1-12-5與RF1處理McIntosh指數大幅增加，而對照則大幅降低，顯著低于RF1-12-5與RF1處理?？傮w看，在整個生育期中，RF1-12-5與RF1處理McIntosh指數差異均不顯著；在大喇叭口期、抽雄期和收獲期，RF1-12-5與RF1處理McIntosh指數顯著高于未種植對照，在乳熟期則相反，顯著低于對照。

Simpson優(yōu)勢度指數指一個群落中常見物種在該群落中的優(yōu)勢程度。從圖2C可以看出，3個處理根際土壤微生物Simpson指數變化趨勢有所不同。RF1-12-5處理Simpson指數在前3個生育期波動幅度較小，在乳熟期顯著降低，而收獲期顯著增高；RF1處理在前4個生育期波動幅度較小，在收獲期顯著增加；對照在大喇口期和抽雄期最低，6 ~ 8葉期和收獲期相當，高于大喇口期和抽雄期，乳熟期Simpson指數最高。在5個時期，RF1-12-5與RF1處理根際土壤微生物Simpson指數均沒有顯著性差異；在乳熟期，RF1-12-5處理Simpson指數顯著低于對照，在收獲期則相反，顯著高于對照。

圖2 不同生育期玉米根際土壤微生物功能多樣性

使用RF1-12-5與RF1處理根際土壤和對照土壤進行微生物群落培養(yǎng)96 h后ECO板得到的吸光度值做主成分分析，得到了3個土壤主要成分的方差貢獻率及累積貢獻率，如表2所示。前14種成分的方差貢獻率達到了100%，前2種主要成分的累積貢獻率達到了69.69%。

以前2個主成分作為橫縱坐標，進行作圖，可以直觀反映出微生物群落對這兩種主成分的利用情況。如圖3所示，可以清楚地看出3種處理在5個生育期對2種主成分碳源的利用情況，兩點之間距離越近越能說明兩者之間對于碳源的利用情況相似。由圖3看出，不同的象限中均有數據分布，在第二象限中數據分布最為密集，有明顯的聚類特征，A1與B1、A4與B4均集中在此象限，A5和B5均集中在第一象限，表明在6 ~ 8葉期、乳熟期、收獲期3個生育期RF1-12-5和RF1處理對前兩種主成分利用相當，同時它們對應的對照則分布在不同象限，表明這3個生育期種植玉米處理和未種植玉米對照之間對碳源的利用差異顯著。在大喇叭口期和抽雄期不同處理之間差異明顯，A2、CK2和B2分別在第二和第四象限，A3、B3、CK3分別在第一、第三和第二象限，3個處理之間數據比較分散，說明這兩個生育期不同處理對碳源的利用差異較大，但總體來說看，這種差異沒有表現出明顯的聚類特征，因此，也未表現明顯的規(guī)律性。

(A1 ~ A5、B1 ~ B5、CK1 ~ CK5分別表示RF-12-5、RF1處理及對照所對應的玉米6 ~ 8葉期、大喇叭口期、抽雄期、乳熟期、收獲期)

3 討論

酶作為高效催化劑，在生化反應中起到關鍵作用。土壤中酶的催化作用控制著土壤中的生物化學進程，進而影響著土壤物質轉化與能量循環(huán)的效率，因此，土壤酶的活性在生態(tài)系統(tǒng)中起到很大的作用[20-21]，同樣，土壤酶活性受環(huán)境影響很大，如溫度、水分、種植模式等均會影響到土壤酶活性[22-24]。本研究發(fā)現，除了過氧化氫酶在收獲期、堿性磷酸酶在乳熟期轉基因玉米RF1-12-5處理和非轉基因玉米RF1處理表現出差異，其他酶活性在玉米的不同生育期RF1-12-5處理與RF1處理均未表現出顯著差異。推斷出現偶然性差異的原因，可能與生育期不同，外界環(huán)境不同有關。顏世磊等[25]同樣發(fā)現，轉Bt基因玉米對土壤酶活性影響產生差異主要是玉米生育期不同造成的，并沒有觀察到轉基因玉米種植對土壤酶活性帶來的顯著影響。本研究還顯示，空白對照土壤酶活性在相應的不同生育期間波動較大，種植玉米處理酶活性波動幅度相對較小，使土壤活性成分更加趨于穩(wěn)定，這也會增加土壤應對環(huán)境變化的能力，有利于玉米的生長。研究顯示長期冬種綠肥可以顯著改變紅壤稻田土壤微生物生物量[26]，棉花種植會增強土壤微生物活性，因此使土壤的酶活性普遍增加，這種作用可以抵消Bt毒素對微生物活性和酶活性可能的負面影響[27]。

本研究表明，轉基因玉米RF-12-5根際土壤微生物的生物多樣性指數、均勻性指數和優(yōu)勢度指數與其親本對照RF1根際土壤相比，差異均不顯著，表明RF-12-5的種植并沒有給玉米根際微生物功能多樣性帶來不利影響。Shen等[28]研究發(fā)現，在任何生長階段和收獲后 Bt和非Bt棉根際土壤微生物群落豐富度沒有差異，接近于未種植對照土壤；Bt棉和非Bt棉根際土壤微生物群落的功能多樣性沒有差異。本研究還發(fā)現，在種植玉米的土壤中，在多個時期土壤微生物群落的功能多樣性指數要比未種植玉米對照土壤高。蔚霞[29]發(fā)現轉Bt基因水稻秸稈還田后物種的豐富度指數、優(yōu)勢度指數和McIntosh指數均大于常規(guī)水稻。這說明玉米的種植會增加土壤微生物的多樣性，這可能與玉米根系分泌物比較豐富，能夠改善根際土壤的微生物環(huán)境有關。

從主成分分析結果來看，在玉米生長的6 ~ 8葉期、乳熟期及收獲期，這3個生育期外界環(huán)境相對穩(wěn)定，玉米生長比較平穩(wěn)，玉米根系分泌物相對較少，因此，轉基因玉米RF1-12-5與非轉基因玉米RF1根際土壤微生物對碳源的利用差異較小，而進入7、8月份，由于降雨頻繁，環(huán)境變化大，玉米進入快速生長期，根系分泌物增多，因此微生物種群活躍，對碳源的利用也表現出了差異。但是從數據分析來看，這種差異與外源基因的導入沒有明顯的關系。

土壤作為礦物、有機物、氣體、液體和無數生物的混合物，成分復雜，受到氣候環(huán)境影響大，性質變化復雜，目前對于土壤微生物及活性成分的研究較少，尤其對于不同地理環(huán)境的探究還有待深入。因此還需要進一步增加不同地域、不同時間的研究，以此增加轉基因作物的環(huán)境評價數據，為轉基因玉米的環(huán)境釋放提供更有力的數據支持。

4 結論

RF1-12-5除了過氧化氫酶在收獲期、堿性磷酸酶在乳熟期酶活性顯著低于RF1，二者根際土壤堿性蛋白酶、脲酶、酸性轉化酶、過氧化氫酶、堿性磷酸酶酶活性在其他各生育期差異均不顯著；RF1-12-5與RF1根際土壤微生物群落的Shannon多樣性指數、McIntosh均勻度指數和Simpson優(yōu)勢度指數均不存在顯著性差異，主成分分析未發(fā)現RF1-12-5與RF1對土壤微生物功能多樣性影響存在規(guī)律性差異。

[1] Clive James. 2016年全球生物技術/轉基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢[J]. 中國生物工程雜志, 2017, 37(4): 1–8

[2] Clive James. 2015年全球生物技術/轉基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢[J]. 中國生物工程雜志, 2016, 36(4): 1–11

[3] 吳新, 包夢醒. Bt抗蟲基因在作物中的應用[J]. 糧食與食品工業(yè), 2014, 21(5): 74–78

[4] 彭昌文. Bt研究概況及進展[J]. 曲阜師范大學學報, 2002, 28(3): 85–88

[5] Sanahuja G, Banakar R, Twyman R M, Capell T, Christou P. Bacillus thuringiensis: A century of research, develop-ment and commercial applications[J]. Plant Biotechnology Journal, 2011, 9(3): 283–300

[6] 喬文靜. 轉基因生物Bt蛋白降解技術研究[D]. 重慶: 西南大學, 2010

[7] 劉新穎. 轉Bt基因玉米對土壤動物群落結構的影響[D]. 哈爾濱: 哈爾濱師范大學, 2016

[8] 沈平, 武玉花, 梁晉剛, 等.轉基因作物發(fā)展及應用概述[J]. 中國生物工程雜志, 2017, 37(1): 119–128

[9] 左嬌, 郭運玲, 孔華, 等. 轉基因玉米安全性評價研究進展[J]. 玉米科學, 2014, 22(1): 73–78

[10] 王理德, 王方琳, 郭春秀, 等. 土壤酶學硏究進展[J]. 土壤, 2016, 48(1): 12–21

[11] 劉玲. 轉Bt基因玉米對土壤微生物多樣性的影響[D]. 蘭州: 甘肅農業(yè)大學, 2011

[12] 王建武, 馮遠嬌, 駱世明. Bt玉米秸稈分解對土壤酶活性和土壤肥力的影響[J]. 應用生態(tài)學報, 2005,16(3): 524–528

[13] 劉凱, 李永山, 范巧蘭, 等. 轉基因玉米對土壤微生物群系的影響[J]. 山西農業(yè)科學, 2015(9): 1138–1140, 1164

[14] 郭維維. 轉基因玉米和水稻對土壤螨類和線蟲群落組成及數量動態(tài)的影響研究[D].南京: 南京農業(yè)大學, 2014

[15] 周禮愷, 張志明. 土壤酶活性的測定方法[J]. 土壤通報, 1980, 11(5): 37–38, 49

[16] 姬艷艷, 張貴龍, 張瑞, 等. 耕作方式對農田土壤微生物功能多樣性的影響[J]. 中國農學通報, 2013(6): 117– 123

[17] 尹艷寧. 抗蟲轉基因棉花對土壤微生物群落結構和功能多樣性的影響[D]. 南京: 南京農業(yè)大學, 2014

[18] 儲成. 轉基因抗蟲棉對土壤微生物多樣性的影響[D].南京: 南京師范大學, 2012

[19] 羅希茜, 郝曉暉, 陳濤, 等. 長期不同施肥對稻田土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 生態(tài)學報, 2009, 29(2): 740–748

[20] 萬忠梅, 宋長春. 土壤酶活性對生態(tài)環(huán)境的響應研究進展[J]. 土壤通報, 2009, 40(4): 951–956

[21] 唐玉姝, 魏朝富, 顏廷梅, 等. 土壤質量生物學指標研究進展[J]. 土壤, 2007, 39(2): 157–163

[22] 王麗娟, 李剛, 趙建寧, 等. 轉基因大豆對根際土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 農業(yè)環(huán)境科學學報, 2013, 32(2): 290–298

[23] 代會會, 胡雪峰, 曹明陽, 等. 豆科間作對番茄產量、土壤養(yǎng)分及酶活性的影響[J]. 土壤學報, 2015, 52(4): 911– 918

[24] 張旭龍, 馬淼, 吳振振, 等. 油葵與光果甘草間作對根際土壤酶活性及微生物功能多樣性的影響[J]. 土壤, 2016, 48(6): 1114–1119

[25] 顏世磊, 趙蕾, 孫紅煒, 等. 大田環(huán)境下轉Bt基因玉米對土壤酶活性的影響[J]. 生態(tài)學報, 2011, 31(15): 4244– 4250

[26] 高嵩涓, 曹衛(wèi)東, 白金順, 等. 長期冬種綠肥改變紅壤稻田土壤微生物生物量特性[J]. 土壤學報, 2015, 52(4): 902–910

[27] Sun C X, Chen L J, Wu Z J, et al. Soil persistence of Bacillus thuringiensis (Bt) toxin from transgenic Bt cotton tissues and its effect on soil enzyme activities[J]. Biology and Fertility of Soils, 2007, 43(5): 617–620

[28] Shen R F, Cai H, Gong W H. Transgenic Bt cotton has no apparent effect on enzymatic activities or functional diversity of microbial communities in rhizosphere soil[J]. Plant and Soil, 2006, 285: 149–159

[29] 蔚霞. 轉Bt基因水稻秸稈還田對水稻土反硝化作用和微生物多樣性的影響[D]. 武漢: 華中農業(yè)大學, 2012

Effects of Transgenic Maize Variety (Double Resistance 12-5) on Enzyme Activity and Microbial Diversity in Rhizosphere Soil

SUN Hongwei, ZHANG Yongxin, XU Xiaohui, GAO Rui, LI Fan, YANG Shuke, LU Xingbo*

(Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Laboratory of Plant Virology, Jinan 250100, China)

The effects of maize variety of Ruifeng 1-double resistance 12-5 (RF1-12-5) on enzyme activity and microbial community in rhizosphere soil were studied to provide scientific safety assessment data for its environmental release and commercial application. The results showed no significant difference existed in the activities of alkali protease, urease, acid invertase between RF1-12-5 and the non-transgenic maize Ruifeng 1 (RF1) in five growth stages of maize. The activities of catalase and alkaline phosphatase were not significant different between RF1-12-5 and RF1 in other growth stages except that catalase activity in harvest stage and alkaline phosphatase activity in milk mature stage were significantly lower for RF1-12-5 than RF1. No significant differences existed in the indexes of Shannon diversity, McIntosh evenness and Simpson dominance of rhizosphere soil microbial communities between RF1-12-5 and RF1 in five growth stages. Principal component analysis proved no regular difference existed between RF1-12-5 and RF1.

Transgenic maize; Rhizosphere soil; Enzyme activity; Microbial diversity; Biolog; Principal component analysis (PCA)

國家轉基因重大專項項目(2015ZX08013-003)和山東省農業(yè)科學院農業(yè)科技創(chuàng)新工程項目(CXGC2017A02)資助。

通訊作者(luxb99@sina.com)

孫紅煒(1973—)，女，山東煙臺人，碩士，研究員，主要從事轉基因植物環(huán)境安全性檢測。E-mail: hongweisun@126.com

S154.2；S154.3

A

10.13758/j.cnki.tr.2019.01.009