俞潔東 曾海松 吳革林等

[摘要] 目的 建立脈絡(luò)通顆粒高效液相（HPLC）指紋圖譜，并采用三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）系統(tǒng)對其化學(xué)成分進行定性分析，為脈絡(luò)通顆粒的質(zhì)量評價提供依據(jù)。 方法 采用Phenomenex Luna C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.3%甲酸溶液為流動相，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測波長270 nm。測定10批脈絡(luò)通顆粒，應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）建立脈絡(luò)通顆粒HPLC指紋圖譜，采用正、負(fù)離子模式對共有峰進行成分分析，并通過現(xiàn)有對照品進行確認(rèn)。 結(jié)果 建立了脈絡(luò)通顆粒HPLC指紋圖譜，共標(biāo)定了21個共有峰，分別歸屬到了8味藥材，液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)指認(rèn)了其中19個共有峰，其中7個采用對照品對比確認(rèn)。 結(jié)論 該方法重現(xiàn)性好、特征性強，能為脈絡(luò)通顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)，并可為其他中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

[關(guān)鍵字] 脈絡(luò)通顆粒;指紋圖譜;共有峰;三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)

[中圖分類號] R286.0? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（a）-0039-04

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint of Mailuotong Granules， and qualitatively analyze its chemical composition by triple quadrupole liquid chromatography-mass （LC-MS） system， and provide evidence for the quality evaluation of Mailuotong Granules. Methods Phenomenex Luna C18 （2） column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was used. Acetonitrile-0.3% formic acid solution was used as mobile phase for gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min， column temperature was 25℃， and the detection wavelength was 270 nm. Ten batches of Mailuotong Granules were determined. The fingerprint of Mailuotong Granules was established with Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine （2004A edition）. The common peaks were analyzed by positive and negative ion modes， and confirmed by the existing reference substances. Results The HPLC fingerprints of Mailuotong Granules were established. A total of 21 common peaks were identified and assigned to 8 herbs. The LC/MS system identified 19 common peaks， 7 of which were confirmed by comparison. Conclusion The method has good reproducibility and strong characteristics， which can provide a basis for the quality control of Mailuotong Granules and provide reference for the material basic research of other traditional Chinese medicine compounds.

[Key words] Mailuotong Granules; Fingerprint; Common peak; Triple quadrupole liquid chromatography-mass system

脈絡(luò)通顆粒是由黨參、當(dāng)歸、地龍、丹參、紅花、木賊、葛根、槐米、山楂、川芎等10味藥材制成，具有益氣活血、化瘀止痛等功效，用于胸痹引起的心胸疼痛、胸悶氣短、頭痛眩暈及冠心病心絞痛諸癥，以及中風(fēng)引起的肢體麻木、半身不遂等癥。目前，藥理和主成分含量測定及大孔樹脂有機殘留物[1-4]是其研究熱點，但缺少整體評價的質(zhì)控方法，無法滿足中藥現(xiàn)代化的要求。

中藥指紋圖譜具有整體性、模糊性和特征性，是國內(nèi)外廣泛認(rèn)可的中藥質(zhì)量評價手段[5-10]。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具有的高效液相色譜的高分離效能和質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性的特點，是控制中藥質(zhì)量的有力工具。本研究建立了脈絡(luò)通顆粒的高效液相指紋圖譜，共標(biāo)定了21個共有峰，并將其歸屬到各藥味;采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和對照品指認(rèn)法對其化學(xué)成分進行指認(rèn)，為脈絡(luò)通顆粒的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（配四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器）、Agilent 6460 Triple Quad LC/MS三重串聯(lián)四極桿（配有ESI電源、Agilent Mass Hunter數(shù)據(jù)處理軟件），美國Agilent公司;XPE-205十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo儀器有限公司）、KQ-250型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

葛根素（生產(chǎn)批號：110752-201514）、蘆?。ㄉa(chǎn)批號：100080-200707）、阿魏酸（生產(chǎn)批號：110773-201614）、黨參炔苷（生產(chǎn)批號：111732-200905）、丹酚酸B（生產(chǎn)批號：11562-201111）、槲皮素（生產(chǎn)批號：10081-9905）、山柰素（生產(chǎn)批號：110861-201310）均購于中國食品藥品檢定研究院;脈絡(luò)通顆粒（揚子江藥業(yè)集團有限公司）。

乙腈為色譜純（德國Merck KGaA公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件? 色譜柱為Phenomenex Luna C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相為乙腈-0.3%甲酸溶液，梯度洗脫：0～3 min，5%乙腈;3～50 min，5%～42%乙腈;50～50.1 min，42%～95%乙腈;50.1～60 min，95%乙腈;流速1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測波長270 nm，進樣量5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件? 采用ESI電離源，正離子模式下：毛細(xì)管電壓3500 V，霧化器壓力35 psi，干燥氣溫度300℃，干燥氣體積流量10 L/min，鞘氣溫度350℃，鞘氣流速11 L/min，碎片電壓135 V，噴嘴電壓1000 V，質(zhì)量掃描范圍m/z 500～1200;負(fù)離子模式下條件與正離子模式相同。

2.2 溶液制備方法

2.2.1 混合對照品溶液制備? 取葛根素、蘆丁、阿魏酸、黨參炔苷、丹酚酸B、槲皮素、山柰素對照品適量，加70%乙醇制成每1 mL含葛根素112 μg、蘆丁204 μg、阿魏酸44 μg、黨參炔苷32 μg、丹酚酸B 92 μg、槲皮素40 μg、山柰素28 μg的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備? 取脈絡(luò)通顆粒2.0 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲（250 W，40 kHz）處理20 min，放冷，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度? 取脈絡(luò)通顆粒（生產(chǎn)批號：16102381）2.0 g，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。以最高峰蘆丁為參照峰，計算標(biāo)定峰的相對保留時間和相對峰面積，并對圖譜進行相似度比較。結(jié)果各峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均≤3.0%，圖譜間的相似度均為1.000，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性? 取脈絡(luò)通顆粒（生產(chǎn)批號：16102381）2.0 g，按照“2.2.2”項下方法制備6份供試品溶液。以最高峰蘆丁為參照峰，計算標(biāo)定峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，并對圖譜進行相似度比較。結(jié)果各峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均≤3.0%，圖譜間的相似度均為1.000，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性? 取脈絡(luò)通顆粒（生產(chǎn)批號：16102381）2.0 g，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于制樣后0、2、4、8、12、16、20、24 h進樣，記錄色譜圖。以最高峰蘆丁為參照峰，計算標(biāo)定峰的相對保留時間和相對峰面積，并對圖譜進行相似度比較。結(jié)果各峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均≤3.0%，圖譜間的相似度均為1.000，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜分析

2.4.1 對照指紋圖譜的建立? 將收集到的14批樣品按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。隨機取10批脈絡(luò)通顆粒的色譜信息，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）對10批樣品進行分析，以S1為參照采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜（R），共標(biāo)定21個共有峰。見圖1。

2.4.2 指紋圖譜分析? 將測定獲得的14批樣品的色譜信息采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）與生成的對照指紋圖譜（R）進行相似度比較評價。14批脈絡(luò)通顆粒相似度均在0.9以上，說明產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性良好。見表1。

2.5 色譜峰指認(rèn)

2.5.1 對照品法指認(rèn)? 利用對照品對各色譜峰的成分進行指認(rèn)。通過比較各峰的保留時間和紫外吸收光譜確定了7個化合物，分別為葛根素、蘆丁、阿魏酸、黨參炔苷、丹酚酸B、槲皮素、山柰素。見圖2。

2.5.2 高效液相色譜-質(zhì)譜法指認(rèn)

比較ESI負(fù)離子和ESI正離子模式條件下供試品溶液的信息情況，發(fā)現(xiàn)黨參酸在ESI負(fù)離子模式條件下無響應(yīng)，山柰素在ESI正離子模式條件下響應(yīng)較弱。見圖2～3。

通過對各成分質(zhì)譜裂解信息的分析，對脈絡(luò)通顆粒中的化學(xué)成分進行結(jié)構(gòu)推測。在對照品法指認(rèn)的7個成分的基礎(chǔ)上又推測出12個成分。結(jié)合文獻[10-21]對HPLC-MS法和對照品指認(rèn)法確認(rèn)的共19個化合物進行歸屬，分別歸屬到8味藥材，即黨參、當(dāng)歸、丹參、木賊、葛根、槐米、山楂、川芎。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法考察

本研究分別對提取溶劑（10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇）、提取溶劑體積（25、50、75 mL）、提取方式（超聲、回流）、提取時間（5、10、20、30、40 min）進行了考察，結(jié)果最佳提取方法為加70%乙醇50 mL超聲提取20 min。

3.2 色譜條件考察

本研究分別對洗脫系統(tǒng)（乙腈-水、乙腈-酸水、甲醇-水、甲醇-酸水）、酸及濃度（甲酸、乙酸、磷酸）、柱溫（20℃、25℃、30℃）、檢測波長及色譜柱進行了考察，最終確定色譜條件為色譜柱Phenomenex Luna C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相為乙腈-0.3%甲酸溶液，梯度洗脫，柱溫25℃，檢測波長270 nm。

本研究建立了脈絡(luò)通顆粒的HPLC指紋圖譜，共標(biāo)定21個化合物，并用高效液相色譜-質(zhì)譜法鑒定了其中19個化合物，其中7個化合物采用對照品進行比對。本品共由10味藥材組成，已鑒定的化合物分別歸屬于8味藥材，提示本研究建立的指紋圖譜符合指紋圖譜對整體性的要求。

[參考文獻]

[1]? 施欣紅，高鋒.脈絡(luò)通顆粒治療腦梗死療效的臨床觀察[J].中國醫(yī)師雜志，2005（S1）：386-387.

[2]? 郭學(xué)文.脈絡(luò)通治療椎基底動脈供血不足性眩暈的臨床研究[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，35（23）：3484-3485.

[3]? 祖若玉，翟燕，趙沈娟，等. HPLC法測定脈絡(luò)通顆粒中葛根素含量[J].中國藥師，2013，13（2）：255-256.

[4]? 趙沈娟，石晶萍，祖若玉，等.頂空氣相色譜法測定脈絡(luò)通顆粒中大孔樹脂有機殘留物[J].藥物分析雜志，2009， 29（3）：458-461.

[5]? 王偉，楊素德，李家春，等.銀翹清熱片HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥，2016，47（11）：1882-1889.

[6]? 周菲菲，王彬杰，張元媛，等.冠心舒通膠囊HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥，2016，47（7）：1137-1141.

[7]? 韋輝，劉素香，劉毅，等.強肝膠囊HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥，2013，44（7）：845-850.

[8]? 常安，王維寧，楊燕云，等.透骨草藥材UPLC指紋圖譜研究[J].中草藥，2016，47（5）：832-836.

[9]? 李強，杜思邈，張忠亮，等.中藥指紋圖譜技術(shù)進展及未來發(fā)展方向展望[J].中草藥，2013，44（22）：3095-3014.

[10]? 陳林偉，秦昆明，徐雪松，等.中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的研究現(xiàn)狀及展望[J].中草藥，2014，45（21）：3041-3047.

[11]? 孫政華，邵晶，郭玫.黨參化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].安微農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，33（57）：174-176.

[12]? 馮佩佩，李忠祥，原忠.黨參屬藥用植物化學(xué)成分和藥理研究進展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2012，4（5）：307-311.

[13]? 李曦，張麗宏，王曉曉，等.當(dāng)歸化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].中藥材，2013，6（49）：1023-1028.

[14]? 杜航，孫佳明，郭曉慶，等.地龍的化學(xué)成分及藥理作用[J].吉林中醫(yī)藥，2014，7（20）：707-709.

[15]? 李巧玉，劉楊，包華音，等.近5年丹參化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].食品與藥品，2014，16（2）：145-146.

[16]? 瞿城，樂世俊，林航，等.紅花化學(xué)成分研究[J].中草藥，2015，46（13）：1872-1877.

[17]? 樸惠順，金光洙.木賊的化學(xué)成分和藥理作用研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17（6）：1077-1078.

[18]? 李國輝，張慶文，王一濤.葛根的化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2011，35（23）：3156-3160.

[19]? 劉麗麗，李曉霞，陳玥.槐米化學(xué)成分研究I[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，33（4）：230-233.

[20]? 樓陸軍，羅潔霞，高云.山楂的化學(xué)成分和藥理作用研究概述[J].中國藥業(yè)，2014，23（3）：92-94.

[21]? 金玉青，洪遠林，李建蕊，等.川芎的化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].中藥與臨床，2013，4（3）：44-48.

（收稿日期：2018-05-22? 本文編輯：王? ?蕾）