孫玉秀，邱 月，項博文，汪忠淼，秦寶麗

0 引言

骨肉瘤是好發(fā)于青少年長骨干骺端的惡性程度極高的原發(fā)性骨腫瘤，其發(fā)病率占全部青少年惡性腫瘤的2.4%[1-2]。骨肉瘤的生物學(xué)特性包括生長迅速、侵襲能力強、遠處轉(zhuǎn)移早等，因此，骨肉瘤患者的預(yù)后較差，并伴有較高的致死率和致殘率[1]。有報道，骨肉瘤的5年生存率極低，約為30%～75%，而且約有80%的患者在臨床上被確診為骨肉瘤時，往往已發(fā)生了肺部或其他部位的轉(zhuǎn)移[3-4]。盡管目前外科切除、腫瘤假體置換、化療放療等綜合治療改善了部分骨肉瘤患者的生存時間，但總體來看，骨肉瘤患者的平均生存期仍然較短[5-6]。目前，對于骨肉瘤的治療的總體思路仍主要局限在針對腫瘤整體，通過腫瘤整體切除并輔助化療的方式，殺死大多數(shù)骨肉瘤細胞，但患者的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率仍得不到良好的控制。目前，基因療法為腫瘤治療提供了新的思路，有針對性地研究骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移的具體發(fā)生機制，找到能夠調(diào)控骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子并明確其作用機制，從而在基因水平調(diào)控骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，具有深遠的理論意義和重要的實際價值。

微小RNA (microRNAs，miRNAs)是一類長度約為20～24 nt的小分子非編碼RNA。miRNAs在個體發(fā)育、細胞分化、增殖及凋亡等生理活動以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展等病理過程中均具有重要的調(diào)控作用[7-8]。既往研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA140-5p (microRNA-140-5p，miR-140-5p)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌、非小細胞肺癌、膀胱癌等多種腫瘤中表達失常，并與腫瘤的多種生物學(xué)行為密切相關(guān)[9-11]。目前，關(guān)于miR-140-5p在骨肉瘤中的研究不多。本研究探討miR-140-5p在骨肉瘤組織及細胞中的表達情況，并研究其對骨肉瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細胞株MG-63及U2OS購自中科院上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒及LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑盒購于美國Invitrogen公司；SYBR Master Mixture購自大連Takara公司；特異性miR-140-5p探針由上海吉瑪基因公司設(shè)計合成；免疫原位雜交試劑盒購于美國BioChain公司；miR-140-5p mimics及NC mimic購于廣州銳博公司；Transwell小室購于美國Corning公司；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細胞株MG-63、U2OS置于DMEM培養(yǎng)基中，人成骨細胞系hFOB1.19細胞置于DMEM/F12培養(yǎng)基中，各培養(yǎng)基均添加10%胎牛血清、100 μg/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素。MG-63、U2OS置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，hFOB1.19置于34 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合率達80%時，以0.25%胰蛋白酶消化并傳代。

1.2.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)染 取生長狀態(tài)佳的MG-6、U2OS細胞接種于6孔板中，接種密度2×105個細胞/孔，24 h后，利用脂質(zhì)體3000分別轉(zhuǎn)染50 nmol/L miR-140-5p mimics和相應(yīng)的NC mimic，具體操作嚴格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行。48 h后進行后續(xù)實驗檢測。

1.2.3 qRT-PCR檢測miR-140-5p的表達 參照Trizol試劑盒說明書提取組織及細胞的總RNA并分組標記。按照Invitrogen的試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物行PCR擴增，PCR過程按Invitrogen的SYBR Green實時熒光定量PCR 試劑盒說明書在熒光定量儀上進行，設(shè)定U6為內(nèi)參照，引物序列如下：上游，5′-CAGTGGTTTTACCCTATGGTAGG-3′，下游5′-CGTGGTTCTACCCTGTGGTAG-3′；U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以miR-140-5p與U6拷貝數(shù)的比值為miR-140-5p的相對表達量。

1.2.4 免疫原位雜交檢測miR-140-5p表達 采用免疫原位雜交試劑盒檢測miR-140-5p表達，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。簡要介紹如下：含有0.5% Triton X-100的1×PBS清洗組織切片后，置入采用含有1%封閉液和miR-140-5p特異性探針的雜交液的濕盒中37 °C孵育過夜。次日，依次采用含有4×、2×、1×的0.1% Tween-20的檸檬酸鈉緩沖溶液清洗3次，每次5 min。室溫下1 × PBS清洗3次，DAPI復(fù)染，顯微鏡下觀察。

1.2.5 Transwell實驗檢測MG-63細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力變化 具體步驟參照Transwell小室說明書。常規(guī)包被底部膜，水化；同步化各組骨肉瘤細胞，調(diào)整計數(shù)并接種，上室內(nèi)加入100 μl含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；下室內(nèi)加入500 μl含20% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2孵育48 h。取出Transwell小室，棉簽擦去Transwell小室內(nèi)部細胞，沖洗，固定，染色，倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)。每組鋪6個Transwell小室，平均值即細胞侵襲的數(shù)量。計算每組6孔的侵襲細胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 miR-140-5p在骨肉瘤組織中的表達 收集42例骨肉瘤組織及相應(yīng)的癌旁組織標本，采用qRT-PCR法檢測miR-140-5p的表達情況，結(jié)果顯示，相比于癌旁組織，miR-140-5p在大部分骨肉瘤組織中表達降低(37/42，88.10%)，見圖1A。同時，應(yīng)用免疫原位雜交的方法檢測miR-140-5p在骨肉瘤組織中的表達情況。結(jié)果顯示，相比于癌旁組織，miR-140-5p在骨肉瘤組織中表達明顯降低(P<0.01)，見圖1B。

2.2 miR-140-5p在骨肉瘤細胞中的表達 應(yīng)用qRT-PCR法檢測miR-140-5p在人成骨細胞hFOB1.19及人骨肉瘤細胞系MG-63、U2OS中的表達情況，結(jié)果顯示，相比于人成骨細胞hFOB1.19，miR-140-5p在骨肉瘤細胞系MG-63及U2OS中的表達明顯降低(P<0.01)，見圖2。結(jié)果提示，miR-140-5p在骨肉瘤中表達降低。

圖1 qRT-PCR法及免疫原位雜交法檢測miR-140-5p在骨肉瘤組織中的表達

圖2 qRT-PCR法檢測miR-140-5p在骨肉瘤細胞系中的表達

2.3 轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimics可上調(diào)MG-63及U2OS細胞內(nèi)miR-140-5p的表達 通過細胞轉(zhuǎn)染的方式，分別在MG-63及U2OS細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimics以上調(diào)其表達水平，并通過qRT-PCR法進行確認。結(jié)果顯示，與NC mimics組比較，轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimics后，MG-63及U2OS細胞內(nèi)miR-140-5p的表達水平明顯升高(P<0.01)，提示轉(zhuǎn)染成功。見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimics后，miR-140-5p在骨肉瘤

2.4 上調(diào)miR-140-5p可抑制骨肉瘤細胞MG-63及U2OS侵襲轉(zhuǎn)移 通過Transwell實驗檢測上調(diào)miR-140-5p對骨肉瘤細胞MG-63及U2OS侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果顯示，上調(diào)miR-140-5p后，MG-63及U2OS細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯減弱(P<0.01)。見圖4。

圖4 上調(diào)miR-140-5p可抑制骨肉瘤細胞MG-63、U2OS侵襲轉(zhuǎn)移

3 討論

非編碼RNA(Non-coding RNA)是指不編碼蛋白質(zhì)的一大類RNA，其共同特點是均由基因組上轉(zhuǎn)錄而來，但是不具備翻譯蛋白的功能，而在RNA水平上能行使各自的生物學(xué)功能，參與表觀遺傳調(diào)控[12]。作為目前非編碼RNA領(lǐng)域的一個研究熱點，miRNAs是在真核生物體內(nèi)廣泛存在的一大類在進化上高度保守的非編碼小分子單鏈RNA[13]。每個獨立的miRNA都可以調(diào)控若干靶基因，創(chuàng)立一個復(fù)雜的基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[14]。miRNA存在的廣泛性和多樣性決定了其具有復(fù)雜、廣泛、多樣的生物學(xué)功能。研究表明，miRNA在多種腫瘤組織中常異常表達，起到了關(guān)鍵的癌基因或抑癌基因的作用[15]。

MiR-140-5p又稱miR-140，位于人染色體16q22.1，全長共含有22個核苷酸，含有1個外顯子。既往研究表明，miR-140-5p在多種腫瘤中均發(fā)揮了重要作用。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p在結(jié)直腸癌組織及細胞系中表達降低，其在結(jié)腸癌增殖侵襲轉(zhuǎn)移過程中可作為腫瘤抑制基因。Lan等[17]報道，miR-140-5p在卵巢癌中表達降低，上調(diào)其表達水平可抑制卵巢癌細胞的增殖能力并促進凋亡的發(fā)生。本研究首先關(guān)注了miR-140-5p在骨肉瘤中的表達情況。通過qRT-PCR及免疫原位雜交的方式，結(jié)果表明，相比于癌旁組織，miR-140-5p在骨肉瘤組織中表達明顯降低。進一步的細胞學(xué)水平檢測顯示，相比于人成骨細胞系hFOB1.19，miR-140-5p在骨肉瘤細胞系MG-63及U2OS中表達同樣降低。以上組織學(xué)及細胞學(xué)水平的檢測結(jié)果證實，miR-140-5p在骨肉瘤中表達降低，初步提示miR-140-5p可能是骨肉瘤的抑癌基因。

目前，關(guān)于miRNAs與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究很多。Jing等[18]在一項下咽鱗狀細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p在下咽鱗狀細胞癌中表達減少，上調(diào)其表達水平可通過抑制亞當金屬肽酶結(jié)構(gòu)域10(ADAM metallopeptidase domain 10，ADAM10)表達的方式抑制FaDu細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。Yang等[19]研究顯示，miR-140-5p在肝細胞癌組織及6個肝細胞癌細胞系中表達減少，miR-140-5p可通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子β (Transforming growth factor β，TGF-β)和促分裂原激活蛋白酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK)的方式抑制肝細胞癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移及增殖。同時，在細胞學(xué)水平關(guān)注了miR-140-5p對骨肉瘤細胞MG-63及U2OS侵襲轉(zhuǎn)移的影響。本研究首先通過細胞轉(zhuǎn)染的方式，將miR-140-5p mimics轉(zhuǎn)染至MG-63及U2OS細胞中，以構(gòu)建miR-140-5p過表達的細胞模型，并通過qRT-PCR法確認轉(zhuǎn)染成功；進一步通過Transwell實驗，考察不同miR-140-5p表達水平對2種骨肉瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果顯示，上調(diào)miR-140-5p后，MG-63及U2OS細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力下降。結(jié)果表明，miR-140-5p可抑制骨肉瘤細胞MG-63及U2OS細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個涉及多通路、多因子、多機制的復(fù)雜的生物學(xué)行為過程。本研究僅僅初步探討了miR-140-5p在骨肉瘤細胞的表達及其對骨肉瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。MiRNAs的下游靶基因眾多，調(diào)控機制較為復(fù)雜，miR-140-5p通過調(diào)控哪些與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的靶基因及其參與骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移的具體機制仍需深入研究。