孫玉秀，邱 月，項(xiàng)博文，汪忠淼，秦寶麗

0 引言

骨肉瘤是好發(fā)于青少年長骨干骺端的惡性程度極高的原發(fā)性骨腫瘤，其發(fā)病率占全部青少年惡性腫瘤的2.4%[1-2]。骨肉瘤的生物學(xué)特性包括生長迅速、侵襲能力強(qiáng)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移早等，因此，骨肉瘤患者的預(yù)后較差，并伴有較高的致死率和致殘率[1]。有報(bào)道，骨肉瘤的5年生存率極低，約為30%～75%，而且約有80%的患者在臨床上被確診為骨肉瘤時(shí)，往往已發(fā)生了肺部或其他部位的轉(zhuǎn)移[3-4]。盡管目前外科切除、腫瘤假體置換、化療放療等綜合治療改善了部分骨肉瘤患者的生存時(shí)間，但總體來看，骨肉瘤患者的平均生存期仍然較短[5-6]。目前，對于骨肉瘤的治療的總體思路仍主要局限在針對腫瘤整體，通過腫瘤整體切除并輔助化療的方式，殺死大多數(shù)骨肉瘤細(xì)胞，但患者的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率仍得不到良好的控制。目前，基因療法為腫瘤治療提供了新的思路，有針對性地研究骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移的具體發(fā)生機(jī)制，找到能夠調(diào)控骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子并明確其作用機(jī)制，從而在基因水平調(diào)控骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，具有深遠(yuǎn)的理論意義和重要的實(shí)際價(jià)值。

微小RNA (microRNAs，miRNAs)是一類長度約為20～24 nt的小分子非編碼RNA。miRNAs在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖及凋亡等生理活動以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展等病理過程中均具有重要的調(diào)控作用[7-8]。既往研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA140-5p (microRNA-140-5p，miR-140-5p)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌等多種腫瘤中表達(dá)失常，并與腫瘤的多種生物學(xué)行為密切相關(guān)[9-11]。目前，關(guān)于miR-140-5p在骨肉瘤中的研究不多。本研究探討miR-140-5p在骨肉瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況，并研究其對骨肉瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63及U2OS購自中科院上海細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒及LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑盒購于美國Invitrogen公司；SYBR Master Mixture購自大連Takara公司；特異性miR-140-5p探針由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)合成；免疫原位雜交試劑盒購于美國BioChain公司；miR-140-5p mimics及NC mimic購于廣州銳博公司；Transwell小室購于美國Corning公司；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63、U2OS置于DMEM培養(yǎng)基中，人成骨細(xì)胞系hFOB1.19細(xì)胞置于DMEM/F12培養(yǎng)基中，各培養(yǎng)基均添加10%胎牛血清、100 μg/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素。MG-63、U2OS置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，hFOB1.19置于34 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合率達(dá)80%時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化并傳代。

1.2.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取生長狀態(tài)佳的MG-6、U2OS細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度2×105個(gè)細(xì)胞/孔，24 h后，利用脂質(zhì)體3000分別轉(zhuǎn)染50 nmol/L miR-140-5p mimics和相應(yīng)的NC mimic，具體操作嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行。48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。

1.2.3 qRT-PCR檢測miR-140-5p的表達(dá) 參照Trizol試劑盒說明書提取組織及細(xì)胞的總RNA并分組標(biāo)記。按照Invitrogen的試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物行PCR擴(kuò)增，PCR過程按Invitrogen的SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒說明書在熒光定量儀上進(jìn)行，設(shè)定U6為內(nèi)參照，引物序列如下：上游，5′-CAGTGGTTTTACCCTATGGTAGG-3′，下游5′-CGTGGTTCTACCCTGTGGTAG-3′；U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以miR-140-5p與U6拷貝數(shù)的比值為miR-140-5p的相對表達(dá)量。

1.2.4 免疫原位雜交檢測miR-140-5p表達(dá) 采用免疫原位雜交試劑盒檢測miR-140-5p表達(dá)，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。簡要介紹如下：含有0.5% Triton X-100的1×PBS清洗組織切片后，置入采用含有1%封閉液和miR-140-5p特異性探針的雜交液的濕盒中37 °C孵育過夜。次日，依次采用含有4×、2×、1×的0.1% Tween-20的檸檬酸鈉緩沖溶液清洗3次，每次5 min。室溫下1 × PBS清洗3次，DAPI復(fù)染，顯微鏡下觀察。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測MG-63細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力變化 具體步驟參照Transwell小室說明書。常規(guī)包被底部膜，水化；同步化各組骨肉瘤細(xì)胞，調(diào)整計(jì)數(shù)并接種，上室內(nèi)加入100 μl含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；下室內(nèi)加入500 μl含20% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2孵育48 h。取出Transwell小室，棉簽擦去Transwell小室內(nèi)部細(xì)胞，沖洗，固定，染色，倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。每組鋪6個(gè)Transwell小室，平均值即細(xì)胞侵襲的數(shù)量。計(jì)算每組6孔的侵襲細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 miR-140-5p在骨肉瘤組織中的表達(dá) 收集42例骨肉瘤組織及相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，采用qRT-PCR法檢測miR-140-5p的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，相比于癌旁組織，miR-140-5p在大部分骨肉瘤組織中表達(dá)降低(37/42，88.10%)，見圖1A。同時(shí)，應(yīng)用免疫原位雜交的方法檢測miR-140-5p在骨肉瘤組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，相比于癌旁組織，miR-140-5p在骨肉瘤組織中表達(dá)明顯降低(P<0.01)，見圖1B。

2.2 miR-140-5p在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá) 應(yīng)用qRT-PCR法檢測miR-140-5p在人成骨細(xì)胞hFOB1.19及人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63、U2OS中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，相比于人成骨細(xì)胞hFOB1.19，miR-140-5p在骨肉瘤細(xì)胞系MG-63及U2OS中的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，見圖2。結(jié)果提示，miR-140-5p在骨肉瘤中表達(dá)降低。

圖1 qRT-PCR法及免疫原位雜交法檢測miR-140-5p在骨肉瘤組織中的表達(dá)

圖2 qRT-PCR法檢測miR-140-5p在骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)

2.3 轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimics可上調(diào)MG-63及U2OS細(xì)胞內(nèi)miR-140-5p的表達(dá) 通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方式，分別在MG-63及U2OS細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimics以上調(diào)其表達(dá)水平，并通過qRT-PCR法進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果顯示，與NC mimics組比較，轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimics后，MG-63及U2OS細(xì)胞內(nèi)miR-140-5p的表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，提示轉(zhuǎn)染成功。見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimics后，miR-140-5p在骨肉瘤

2.4 上調(diào)miR-140-5p可抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63及U2OS侵襲轉(zhuǎn)移 通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測上調(diào)miR-140-5p對骨肉瘤細(xì)胞MG-63及U2OS侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果顯示，上調(diào)miR-140-5p后，MG-63及U2OS細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯減弱(P<0.01)。見圖4。

圖4 上調(diào)miR-140-5p可抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63、U2OS侵襲轉(zhuǎn)移

3 討論

非編碼RNA(Non-coding RNA)是指不編碼蛋白質(zhì)的一大類RNA，其共同特點(diǎn)是均由基因組上轉(zhuǎn)錄而來，但是不具備翻譯蛋白的功能，而在RNA水平上能行使各自的生物學(xué)功能，參與表觀遺傳調(diào)控[12]。作為目前非編碼RNA領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，miRNAs是在真核生物體內(nèi)廣泛存在的一大類在進(jìn)化上高度保守的非編碼小分子單鏈RNA[13]。每個(gè)獨(dú)立的miRNA都可以調(diào)控若干靶基因，創(chuàng)立一個(gè)復(fù)雜的基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[14]。miRNA存在的廣泛性和多樣性決定了其具有復(fù)雜、廣泛、多樣的生物學(xué)功能。研究表明，miRNA在多種腫瘤組織中常異常表達(dá)，起到了關(guān)鍵的癌基因或抑癌基因的作用[15]。

MiR-140-5p又稱miR-140，位于人染色體16q22.1，全長共含有22個(gè)核苷酸，含有1個(gè)外顯子。既往研究表明，miR-140-5p在多種腫瘤中均發(fā)揮了重要作用。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)降低，其在結(jié)腸癌增殖侵襲轉(zhuǎn)移過程中可作為腫瘤抑制基因。Lan等[17]報(bào)道，miR-140-5p在卵巢癌中表達(dá)降低，上調(diào)其表達(dá)水平可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖能力并促進(jìn)凋亡的發(fā)生。本研究首先關(guān)注了miR-140-5p在骨肉瘤中的表達(dá)情況。通過qRT-PCR及免疫原位雜交的方式，結(jié)果表明，相比于癌旁組織，miR-140-5p在骨肉瘤組織中表達(dá)明顯降低。進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)水平檢測顯示，相比于人成骨細(xì)胞系hFOB1.19，miR-140-5p在骨肉瘤細(xì)胞系MG-63及U2OS中表達(dá)同樣降低。以上組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)水平的檢測結(jié)果證實(shí)，miR-140-5p在骨肉瘤中表達(dá)降低，初步提示miR-140-5p可能是骨肉瘤的抑癌基因。

目前，關(guān)于miRNAs與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究很多。Jing等[18]在一項(xiàng)下咽鱗狀細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p在下咽鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)減少，上調(diào)其表達(dá)水平可通過抑制亞當(dāng)金屬肽酶結(jié)構(gòu)域10(ADAM metallopeptidase domain 10，ADAM10)表達(dá)的方式抑制FaDu細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。Yang等[19]研究顯示，miR-140-5p在肝細(xì)胞癌組織及6個(gè)肝細(xì)胞癌細(xì)胞系中表達(dá)減少，miR-140-5p可通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子β (Transforming growth factor β，TGF-β)和促分裂原激活蛋白酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK)的方式抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及增殖。同時(shí)，在細(xì)胞學(xué)水平關(guān)注了miR-140-5p對骨肉瘤細(xì)胞MG-63及U2OS侵襲轉(zhuǎn)移的影響。本研究首先通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方式，將miR-140-5p mimics轉(zhuǎn)染至MG-63及U2OS細(xì)胞中，以構(gòu)建miR-140-5p過表達(dá)的細(xì)胞模型，并通過qRT-PCR法確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功；進(jìn)一步通過Transwell實(shí)驗(yàn)，考察不同miR-140-5p表達(dá)水平對2種骨肉瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果顯示，上調(diào)miR-140-5p后，MG-63及U2OS細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力下降。結(jié)果表明，miR-140-5p可抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63及U2OS細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多通路、多因子、多機(jī)制的復(fù)雜的生物學(xué)行為過程。本研究僅僅初步探討了miR-140-5p在骨肉瘤細(xì)胞的表達(dá)及其對骨肉瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。MiRNAs的下游靶基因眾多，調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，miR-140-5p通過調(diào)控哪些與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的靶基因及其參與骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制仍需深入研究。