白 潔，英子偉，趙 林，李偉杰，王 聰，謝賢鑫，姜大慶

0 引言

近年來，隨著以手術(shù)治療為基礎(chǔ)的化療、放療及靶向治療的發(fā)展，乳腺癌的復(fù)發(fā)率及病死率有下降趨勢，但是并沒有突破性進展[1-3]。靶向治療及中藥單劑的開發(fā)是未來乳腺癌綜合治療的重要研究內(nèi)容。中藥大黃中的單劑，如大黃素，對乳腺癌、胃癌及肺癌等腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖、促進凋亡的作用。大黃素甲醚是大黃的組分之一，其對肝癌及胰腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用[4-5]。miR-21在乳腺癌中為高表達，對乳腺癌細(xì)胞增殖具有促進作用，對凋亡具有抑制作用，其作用靶基因包括PDCD4、TPM1及PTEN等[6]。目前還沒有大黃素甲醚對乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用及機制研究。本研究通過觀察大黃素甲醚對乳腺癌細(xì)胞的作用，為乳腺癌的中藥單劑治療提供研究基礎(chǔ)，為大黃素甲醚在惡性腫瘤中應(yīng)用的進一步研究提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞株(HCC1937、MCF-7)購自中科院上海細(xì)胞庫，在中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院中心實驗室培養(yǎng)傳代。大黃素甲醚(CAS No：521-61-9)標(biāo)準(zhǔn)品購自成都瑞芬思生物科技有限公司。PDCD4多克隆抗體購自美國Sigma公司。RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，miRNA提取分離試劑盒、All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒及MTT試劑盒購購自美國Abcom公司。引物由大連寶生生物技術(shù)有限公司進行設(shè)計及合成，miR-21 forward：5′-CGTATGTGAGTCTTCAGCTG-3′；reverse：5′-TTTGTCTGAGGGCACAACTC-3′。GAPDH forward：5′-GGAAGTGGGAATCGGAGTC-3′；reverse：5′-GAATAGGGATGTGATGGTTC-3′。試驗組為給予大黃素甲醚、miR-21 mimics或miR-21 inhibitor干預(yù)的細(xì)胞組，對照組為未給予干預(yù)細(xì)胞組。

1.2 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖 收集培養(yǎng)14 d的乳腺癌細(xì)胞按10∶1效靶比混合，加入96孔板，另設(shè)靶細(xì)胞和單獨效應(yīng)細(xì)胞組，每組設(shè)5個復(fù)孔，放置37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，每孔加CCK8 10 μl，37 ℃ 孵育4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測OD值，計算大黃素甲醚干預(yù)后細(xì)胞存活率。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取轉(zhuǎn)染48 h對數(shù)期乳腺癌細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI雙染色凋亡檢測試劑盒說明書操作步驟進行操作，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，Cell Quest軟件進行結(jié)果分析，以早期凋亡及晚期凋亡陽性細(xì)胞的百分比例之和作為凋亡率進行統(tǒng)計分析，實驗重復(fù)3次。

1.4 qRT-PCR 取乳腺癌細(xì)胞，依照Trizol試劑盒操作說明書進行總RNA提取及純化，紫外吸收法檢測RNA質(zhì)量。應(yīng)用變性瓊脂糖凝膠電泳方法對RNA完整性進行測定。合成樣品cDNA、進行梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品的管家基因(β-actin)實時定量PCR、進行制備繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線DNA模板，實時定量PCR進行待測基因的檢測，將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應(yīng)。ΔΔCt法對溶解曲線進行分析。

1.5 Western blot 對乳腺癌細(xì)胞株進行預(yù)處理后定量蛋白濃度。采用蛋白裂解液裂解蛋白后震蕩及搖勻，抽提總蛋白，提取上清液，BCA定量試劑盒定量蛋白濃度。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉于室溫條件下封閉90 min后加入一抗，孵育過夜后加入二抗，再次孵育后采用化學(xué)發(fā)光法顯色，β-actin為內(nèi)參照。采用QuantityOne分析灰度值，結(jié)果表示為蛋白相對表達量=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值。

1.6 miR-346 mimics或inhibitor轉(zhuǎn)染乳腺癌的細(xì)胞 對數(shù)生長期乳腺癌細(xì)胞消化為單細(xì)胞的懸液，以20×104/孔的細(xì)胞數(shù)接種到24孔板中，依照Lipo2000說明書步驟對融合高于70%的細(xì)胞株轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染完成后改為含10%胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后以qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率進行下一步實驗。

2 結(jié)果

2.1 大黃素甲醚對乳腺癌細(xì)胞存活率的作用 CCK-8檢測顯示，與空白對照組對比，給予不同濃度梯度(0.5、5、50、500 μg/ml)大黃素甲醚培養(yǎng)48 h的HCC1937、MCF-7乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞存活率均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A、圖1B；經(jīng)5 μmol/L濃度大黃素甲醚處理的HCC1937及MCF-7乳腺癌細(xì)胞在培養(yǎng)48、72、96 h細(xì)胞存活率均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1C、圖D。

2.2 大黃素甲醚對乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用 流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，與空白對照組對比，分別給予不同濃度梯度(0.5、5、50、500 μg/ml)大黃素甲醚培養(yǎng)48 h的HCC1937、MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 大黃素甲醚對miR-21調(diào)控作用 qRT-PCR檢測顯示，與空白對照組比較，分別給予5 μg/ml大黃素甲醚干預(yù)的HCC1937及MCF-7細(xì)胞miR-21表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3A。Western blot檢測顯示，與空白對照組比較，給予5 μg/ml大黃素甲醚干預(yù)的HCC1937、MCF-7細(xì)胞PDCD4蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3B。Western blot檢測顯示，與陰性對照組比較，給予miR-21 mimics干擾的HCC1937、MCF-7細(xì)胞PDCD4蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3C。給予miR-21 inhibitor干擾的HCC1937、MCF-7細(xì)胞PDCD4蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3D。

3 討論

在乳腺癌治療方面，隨著靶向藥物及化療的發(fā)展，生存期也在延長，但其病死率及復(fù)發(fā)率并沒有得到明顯改善[2]。中藥單劑抗腫瘤的研發(fā)是目前進展期乳腺癌治療的熱點方向。中藥單劑具有殺傷腫瘤細(xì)胞、減少化療藥物應(yīng)用劑量及化療增效作用，并能夠減少化療不良反應(yīng)[7]。大黃素甲醚是植物大黃中的重要組分之一，作為大黃的復(fù)合成分，用于抗炎、導(dǎo)瀉及抗腫瘤治療，在抗腫瘤方面，具有阻斷細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖及促進凋亡的作用[8]。微小miR-21在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，對乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲具有調(diào)控作用[9]。有研究顯示，大黃素甲醚的靶點包括EMMPRIN、miR370、DNMT等[10]。本研究對大黃素甲醚在乳腺癌細(xì)胞中的作用與miR-21的靶向調(diào)節(jié)機制進行了觀察。

圖1 CCK-8試驗檢測

注：A.不同濃度梯度大黃素甲醚培養(yǎng)48 h的HCC1937細(xì)胞存活率，B.不同濃度梯度大黃素甲醚培養(yǎng)48 h的MCF-7細(xì)胞存活率，C.經(jīng)5 μmol/L濃度大黃素甲醚處理的HCC1937細(xì)胞存活率，D.經(jīng)5 μmol/L濃度大黃素甲醚處理的MCF-7細(xì)胞存活率

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度梯度大黃素甲醚培養(yǎng)48 h后HCC1937細(xì)胞(A)、MCF-7細(xì)胞(B)凋亡率

圖3 兩組HCC1937、MCF-7細(xì)胞miR-21、PDCD4蛋白表達比較

注：A.qRT-PCR檢測大黃素甲醚干預(yù)的HCC1937、MCF-7細(xì)胞miR-21表達；B.Western blot檢測大黃素甲醚干預(yù)的HCC1937、MCF-7細(xì)胞PDCD4蛋白表達；C.Western blot檢測給予miR-21 mimics干擾的HCC1937、MCF-7細(xì)胞PDCD4蛋白表達；D.Western blot檢測給予miR-21 inhibitor干擾的HCC1937、MCF-7細(xì)胞PDCD4蛋白表達

本研究結(jié)果顯示，給予不同濃度梯度大黃素甲醚培養(yǎng)48 h的HCC1937及MCF-7乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞存活率下降，經(jīng)大黃素甲醚處理的HCC1937及MCF-7乳腺癌細(xì)胞在培養(yǎng)48、72、96 h的細(xì)胞存活率均下降。結(jié)果表明，大黃素甲醚對乳腺癌細(xì)胞具有殺滅作用，并具有劑量、時間依賴性。本研究進一步顯示，給予不同濃度梯度大黃素甲醚培養(yǎng)48 h的HCC1937、MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡率均升高，表明大黃素甲醚對乳腺癌細(xì)胞凋亡具有促進作用。Hong等[11]研究顯示，大黃素甲醚誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞停留在G0/G1期，從而促進其凋亡，抑制其增殖。本研究在HCC1937及MCF-7乳腺癌細(xì)胞中得出的結(jié)論與其相同。本研究進一步顯示，給予大黃素甲醚干預(yù)的HCC1937及MCF-7細(xì)胞miR-21表達降低，PDCD4蛋白表達升高，表明大黃素甲醚可能對miR-21及PDCD4蛋白表達具有調(diào)控作用。給予miR-21 mimics干擾的HCC1937及MCF-7細(xì)胞PDCD4蛋白表達降低，而給予miR-21 inhibitor干擾的HCC1937及MCF-7細(xì)胞PDCD4蛋白表達升高，表明PDCD4可能是miR-21的靶蛋白，大黃素甲醚通過調(diào)控miR-21表達，介導(dǎo)PDCD4蛋白表達，對乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡進行調(diào)控。Venturutti等[12]研究顯示，上調(diào)miR-21表達引起PDCD4表達水平降低，PDCD4是miR-21的靶蛋白。Frankel等[13]研究顯示，PDCD4是miR-21重要的靶基因，miR-21通過調(diào)控PDCD4表達從而介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及遷移等惡性行為。Han等[14]研究認(rèn)為，大黃素甲醚通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子SOX2表達抑制直腸癌SW620細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為。Chen等[15]研究認(rèn)為，大黃素甲醚通過下調(diào)EMMPPRIN表達誘發(fā)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。李燕等[4]研究認(rèn)為，大黃素通過調(diào)節(jié)miR-370表達從而對AMPK/SP1/DNMT1信號通路進行調(diào)控，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果均表明，大黃素甲醚可以對靶基因進行調(diào)控，從而介導(dǎo)下游通路的生物學(xué)功能，影響腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡等惡性行為。

綜上所述，大黃素甲醚對乳腺癌細(xì)胞具有殺傷作用，這種作用是通過miR-21介導(dǎo)的PDCD4通路實現(xiàn)的，但其作用機制仍有待于進一步研究。