倪 敏 ， 章 豪 ，劉婷婷 ， 潘 楊

（1.蘇州科技大學 江蘇省環(huán)境科學與工程重點實驗室，江蘇 蘇州 215009；2.蘇州科技大學 環(huán)境科學與工程學院，江蘇 蘇州215009）

實時熒光定量PCR（Real-time Flurescent Quantitive Po1ymerase Chain Reaction，qPCR）技術于1995年由美國PE公司推出，Heid[1]等首先就其原理及方法進行了報道。該技術的推行實現(xiàn)了對環(huán)境微生物菌種及功能基因進行定性和絕對定量的檢測，打破了傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)困難、親緣關系較近菌種無法區(qū)分鑒別、各進化分支菌種分類研究止步不前等瓶頸，特異性強、靈敏度高、操作簡便無毒害，目前已在動植物基因工程[2]、微生物[3]、醫(yī)學領域[4]和環(huán)境領域[5]中得到廣泛應用。

活性污泥法作為一種新型的微生物污水處理技術，在城市污水處理中應用廣泛。處理過程主要依靠生物量豐富的微生物聚集體——“菌膠團”，分解污水中的有機物，并不斷進行新陳代謝，達到連續(xù)處理廢水的目的[6]。相比于物理和化學處理技術，基于微生物代謝作用的活性污泥法具有處理效果好、工程造價相對較低、運行成本低廉等優(yōu)點[7]。污水處理過程中微生物優(yōu)勢菌種群落結構的變化及豐度與工藝的穩(wěn)定運行密切相關。qPCR應用于檢測活性污泥微生物的目標基因，反映微生物的群落結構或功能。qPCR對微生物的準確定量和定性有助于解析污水處理的過程及機制，對反應工藝的穩(wěn)定運行提供指導。

1 環(huán)境活性污泥樣品的特點

環(huán)境活性污泥樣品是指在環(huán)境水處理領域中，使用生物法進行脫氮除磷處理所馴化產生的具有功能微生物的污泥，具有以下特點：（1）樣品來源多樣，有城市生活污水處理廠底泥、垃圾處理堆滲濾液、工業(yè)廢水處理廠、河道底泥、湖泊底泥等；qPCR通用的細菌引物可以針對不同來源的樣品，檢測相同的菌種，為不同來源樣品菌種種類和豐富度的比較提供可能。（2）成分復雜，微生物種類豐富，原生動物、后生動物、古菌、原核生物、真核生物并存；qPCR應用于微生物種類的定性和定量研究需建立在能設計特異性引物的前提下，特異性引物的設計提高了檢測的針對性，避免了純菌檢測的復雜性。（3）雜質多樣，后續(xù)分析干擾因素較多，腐殖酸、蛋白質、糖類、酚類、重金屬等各種有機物無機物混合，同時含有各種酶類，其中核酸酶對基因組的抽提產生較大的干擾，如核糖核酸酶會降解RNA，對RNA的抽提得率產生抑制[8]，腐殖酸在基因組中的殘留，容易抑制酶的活性，從而對qPCR的擴增產生抑制，影響檢測結果的準確性[9-10]；qPCR前處理過程的基因組抽提和純化在基因組濃度和質量方面有統(tǒng)一的要求，標準的操作過程減少了樣品雜質的異質性對實驗結果準確性的影響。（4）環(huán)境活性污泥樣品的分析主要集中于原核生物的分析，對特定菌種和特定基因的定性和定量主要通過制備濃度已知的標準品進行實時熒光定量PCR——絕對定量，絕對定量靈敏、準確、認可度高，但對操作環(huán)境、人員素質的要求較高；qPCR絕對定量彌補了相對定量及常規(guī)的分子生物學方法在微生物數(shù)量統(tǒng)計方面的不足。（5）原核生物16S rDNA有11個恒定區(qū)和9或10個可變區(qū)，保守序列區(qū)域反映了生物物種間的親緣關系，而高變序列區(qū)域則能體現(xiàn)物種間的差異[11]。常用的V4或V3-V4可變區(qū)擴增子測序或DGGE變性梯度凝膠電泳對于親緣關系較近的物種實際區(qū)分效果不太理想，qPCR較好的特異性彌補了二者的不足。（6）微生物含量豐富，只有不到十分之一的微生物實現(xiàn)了純培養(yǎng)，好多微生物菌種無法實現(xiàn)純培養(yǎng)，這局限了qPCR引物序列設計的特異性，好多菌種的qPCR使用的是該菌種的16S rDNA引物，可能會產生非特異性擴增和引物二聚體，需要進一步開發(fā)和完善原核生物功能基因qPCR引物，結合菌種功能基因代謝學機制闡釋工藝處理性能的變化；qPCR的應用將微生物種類變化、功能基因表達、微生物代謝組學研究、酶活分析等與工藝的運行和調控有機的結合起來，為未來污水處理工藝的優(yōu)化提供微生物生長方面的新指導。（7）活性污泥樣品qPCR對基因組模板的純度和質量要求較高，選擇合適的基因組抽提方法，進行有效的純化，對活性污泥qPCR結果準確性的影響意義深遠；qPCR自動化抽提方法在環(huán)境領域的推廣應用降低了對工科學生生物學知識和生物學技能的要求，使qPCR的檢測更加便捷、準確。

2 實時熒光定量PCR技術在環(huán)境污水生物處理領域的應用

2.1 在生物脫氮系統(tǒng)中對優(yōu)勢菌及功能基因的分析

亞硝酸鹽氧化菌（NOB）、氨氧化菌（AOB）、氨單加氧酶基因（amoA）、nirS（cd1型亞硝酸鹽還原酶基因）、nirK（Cu亞硝酸鹽還原酶基因）、norB（一氧化氮還原酶基因）和nosZ（氧化亞氮還原酶基因）等的數(shù)量和空間分布與微生物硝化反硝化過程息息相關，可作為調控污水脫氮工藝的參數(shù)，qPCR技術的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng)方法步驟繁瑣、耗時長、易污染等問題，廣泛應用于生物脫氮工藝微生物種群結構和功能變化研究中。在工藝運行性能的機制解釋方面，Abzazou T等使用gBlocks基因片段方法制備新DNA標準品用于qPCR，采用qPCR方法對兩個不同的污水處理廠總細菌、AOB、NOB含量進行定量，結果表明，兩個污水處理廠微生物譜存在顯著差異，在營養(yǎng)鹽去除的工廠中硝化細菌群落豐富，與工藝運行性能一致[12]。在對氮的去除起到關鍵作用的反硝化功能基因的定量方面，LiuWenzhi等人，使用qPCR定量了反硝化菌群nirK和nirS基因的多樣性和豐度，結合環(huán)境因素及水的物理指標，得出長江湖泊主要受非生物因素的調控主導氮的去除，而非生物群落的多樣性和豐度[13]。此外，MirenMartínez-Santos等人使用qPCR技術定量反硝化功能基因 （nir：nirS+nirK），結合16S rRNA基因代謝結構分析，揭示了硫化物驅動的自養(yǎng)反硝化作用優(yōu)于異養(yǎng)反硝化作用，不完全異養(yǎng)反硝化作用對受處理和未經處理的廢水表層沉積物的影響中占主導地位，處理過的和未經處理的廢水排放改變了河流沉淀物中參與氮和硫循環(huán)的細菌群落[14]。為了有效地從低碳氮比的廢水中去除氮，Yang Yunlong等通過使用過的蘑菇堆肥水解物序批反應器提高了氮的去除，qPCR對活性污泥中的功能基因包括amoA，nirS/K、norB和nosZ進行定量，添加蘑菇堆肥水解物后其中大部分基因的表達升高，由此得出微生物的變化有利于污染物的去除和工藝的穩(wěn)定運行[15]。在提高氮的去除率方面，Wang Xiaoyuan等人使用qPCR研究支流加入的有機質負荷、BOD5/TN和NO2-N/NH4-N的比例通過厭氧氨氧化菌和反硝化反應對結合態(tài)氮去除的影響研究，得出通過調控加入的支流量提高氮的去除率比較可行[16]。在限制含氮有機物排放方面，Castellano-Hinojosa A等在開展一氧化二氮的排放與硝化脫氮原核生物種群動力學關系的研究中，使用qPCR對西班牙南部四個全規(guī)模的污水處理廠活性污泥中氨氧化細菌AOB、氨氧化古菌AOA和N2O還原反硝化菌的含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)AOA的含量與N2O的排放負相關，其不能對N2O生成產生突出的貢獻，活性污泥中NO3-和NO2-的含量越高AOB的數(shù)量越多[17]。

2.2 在生物除磷系統(tǒng)中對聚磷菌及聚合磷酸鹽激酶基因（PPK1）標記的Accumulibacter各進化分支的分析

污水處理的生物除磷系統(tǒng)主要通過磷酸鹽積累的聚磷菌（PAO）厭氧釋磷、好氧吸磷來實現(xiàn)，借助實時熒光定量PCR技術可深入分析微生物的種類和含量變化，結合微生物的代謝特性和功能基因的關鍵作用，有助于進一步深入研究除磷機理、優(yōu)化除磷工藝。無論是主流工藝還是側流分支改進工藝，qPCR對PAO及除磷能力標記基因——編碼聚合磷酸鹽激酶的功能基因PPK1的研究從不同角度揭示了工藝除磷性能及運行調控策略。主流的強化生物除磷（EBPR）能夠用于去除含磷濃度很高的廢水，Erik R.等采qPCR方法研究合成廢水和真正廢水培養(yǎng)馴化的全規(guī)模EBPR處理系統(tǒng)中微生物生態(tài)學特點，以合成廢水為基礎的MMC顯示了對PAO擴增子檢測效果最好，引起了人們對使用合成底物開展的EBPR研究潛在相關性的關注[18]。在側流工藝中，Md.Shahinoor Islam等利用創(chuàng)新的缺氧-需氧-厭氧側流處理系統(tǒng)從城市污水中去除生物磷，qPCR檢測磷酸鹽積累菌PAO豐度和多樣性較高，結合對細菌進一步的分析表明，PAO種屬多樣性包括：CandidatusAccumulibacterphosphatis、Tetrasphaera、Rhodocyclus、脫氮聚磷菌（DPAO），研究選擇性強化磷去除比傳統(tǒng)的主流工藝具有優(yōu)勢[19]。在功能標記基因PPK1的研究中，CandidatusAccumulibacter是污水生物除磷系統(tǒng)中的優(yōu)勢聚磷菌，張麗敏等人采用編碼聚合磷酸鹽激酶的功能基因PPK1作為遺傳標記，通過qPCR對9個污水處理廠共12個活性污泥樣品中Accumulibacter的進化枝水平的豐度及其菌群結構進行了研究，得出每個樣品中Accumulibacter分支多樣化，均含有IIA、IIC、IID分支，生物除磷效果與Accumulibacter的群落結構密切相關，除磷效果不好可能和IID占總Accumulibacter比例較高有關[20]。此外，Zeng Wei等人采用改進后的開普敦大學（MUCT）工藝以低碳氮比（C/N）處理城市污水，采用PPK1作為遺傳標記進行qPCR檢測，得到總的 “CandidatusAccumulibacter”及其五個分支的種類和含量，通過對五個分支在“CandidatusAccumulibacter”中的占比接近100%及各含量的動態(tài)結構變化與工藝性能之間響應關系的分析，揭示亞硝酸鹽途徑反硝化除磷效果好的原因以及在處理碳源有限的廢水時亞硝酸鹽可作為合適的反硝化除磷的電子受體[21]。在脫氮除磷的混合廢水處理領域，Dobbeleers T等人研究了來自馬鈴薯工業(yè)厭氧預處理的好氧亞硝酸鹽顆粒廢水，qPCR分析表明微生物生長緩慢，尤其是被厭氧處理模式所刺激的積累聚磷酸鹽的聚磷菌PAO，這就解釋了好氧亞硝酸鹽顆粒的除磷效率達到65.7%的原因，同時解釋了脫氮能力變化受PAOs生長的影響[22]。

3 實時熒光定量PCR技術在環(huán)境污水生物處理領域的應用

表1所列為國產和進口基因組提取試劑盒抽提的基因組濃度和質量；其中國產試劑盒使用的是天根生化科技有限公司的土壤基因組DNA提取試劑盒、DP336，按照試劑盒的使用說明抽提500 mg厭氧氨氧化反應器活性污泥，設立A1、A2、A3三組平行；進口試劑盒使用的是美國MP公司的Fast DNA Spin kit for soil、MP-116560，按照試劑盒的使用說明抽提500 mg厭氧氨氧化反應器活性污泥，設立B1、B2、B3三組平行。

表2所列為手動抽提和自動抽提基因組濃度和質量；其中手動抽提體系是500 mg城市污水處理廠氧化溝工藝濃縮池活性污泥，按照美國MP公司的Fast DNA Spin kit for soil、MP-116560試劑盒的說明書進行，設立C1、C2、C3三組平行；自動抽提的體系是350 mg城市污水處理廠氧化溝工藝濃縮池活性污泥+800 μL裂解液+100 μL洗脫液根據(jù)德國耶拿細菌基因組抽提試劑盒的操作步驟，使用德國耶拿InnuPure C16儀器中的DNAexteralLysisC1601程序進行自動抽提，設立D1、D2、D3三組平行。

表1 國產和進口基因組提取試劑盒抽提的基因組濃度和質量

表2 手動抽提和自動抽提基因組濃度和質量

實時熒光定量PCR技術應用在環(huán)境污水處理領域主要是絕對定量，實驗流程包括：基因組的抽提、純化、引物的設計合成、標準品制備、標準曲線制備和樣品上機分析等，從各個流程根據(jù)環(huán)境活性污泥樣品的特點和研究的目標現(xiàn)提供以下幾點應用建議：（1）根據(jù)表1所示，對比國產試劑盒（天根生化科技有限公司的土壤基因組DNA提取試劑盒、DP336）和進口試劑盒（美國MP公司的Fast DNA Spin kit for soil、MP-116560）的OD260/230、OD260/280、基因組濃度的平均值可知，進口的試劑盒三者平均值皆高于國產試劑盒，說明進口試劑盒抽提的基因組濃度和質量較高，進口試劑盒成本雖略高于國產試劑盒，在條件允許的前提下，抽提基因組最好選擇進口的試劑盒，以便滿足后續(xù)的qPCR實驗對基因組質量和濃度的要求。（2）表2中顯示了來源于城市污水處理廠氧化溝工藝濃縮池的活性污泥，使用手動抽提和自動抽提的方法測得最后的OD260/230、OD260/280、基因組濃度等數(shù)值，對比可以發(fā)現(xiàn)自動抽提的OD260/230、OD260/280平均值都高于手動抽提的結果，說明自動抽提的基因組質量較好；基因組濃度低于手動抽提，這與實驗前所用的污泥量較少和自動體系抽提純化過程較嚴格損耗稍多有關，但是自動抽提的基因組濃度能夠滿足qPCR分析；與此同時，自動抽提基因組只需實驗人員將樣品研磨充分后連同試劑盒一起裝機，選定好程序，歷時超過50 min，即可拿出抽提好的基因組，無需經過純化步驟，抽提的濃度和質量可應用于qPCR實驗；比手動抽提耗時短、門檻要求低，對環(huán)境領域的工科學生具有較普遍的適用性。在未來環(huán)境實驗室設備配置方面，可考慮自動化的基因組抽提儀器，如德國耶拿InnuPure C16儀器。（3）qPCR對基因組質量的要求較高，除了OD260/280、OD260/230數(shù)值方面的評估，實驗前可設計特異性的引物，進行普通的PCR，結合瓊脂糖凝膠電泳圖條帶是否明亮單一，優(yōu)化實驗條件體系，找到qPCR較好的退火溫度和延伸時間，降低qPCR預實驗的成本，提高結果的準確性。（4）標準品的制備方法常規(guī)的有兩種：質粒標準品[23]和基因組純化產物標準品[24]，質粒標準品比較穩(wěn)定、制備復雜，基因組純化產物標準品制備簡單、適用性有限，常見典型菌種的qPCR分析可使用基因組純化產物作為標準品，比如AOB、NOB、總細菌等。

4 結語

qPCR技術作為一種生物監(jiān)測方法越來越廣泛地應用于污水處理生物脫氮除磷領域微生物的檢測，未來的研究重點和方向是在qPCR技術對微生物種類和豐度檢測的基礎上建立工藝運行性能與微生物種群結構變化之間的動態(tài)響應關系，為工藝的穩(wěn)定運行及優(yōu)化調控提供指導。應對的策略和發(fā)展趨勢是從qPCR技術前處理到上機及數(shù)據(jù)分析環(huán)節(jié)，建立系統(tǒng)的操作規(guī)程，推廣應用自動化的基因組抽提體系，簡化實驗操作難度，使qPCR技術在環(huán)境污水處理領域得以推廣?；谖⑸锞N純培養(yǎng)及新引物設計的難題，qPCR技術主要適用于公開發(fā)表文獻中報道的有引物的菌種或菌種的功能基因，解決和簡化新菌種或功能基因引物序列設計的問題，尋求合適的內參基因進行相對定量，是未來qPCR技術得以推廣使用更好地為生物脫氮除磷工藝服務的努力新方向。