王可 閆鵬 張恒亮 趙希坤 趙飛龍 王騰飛 董平栓

河南科技大學第一附屬醫(yī)院，心血管內科重癥病區(qū)（河南洛陽471000）

糖尿病心臟病變是指糖尿病患者因血糖、血脂等代謝紊亂進一步引起的心臟微血管、大血管以及心肌組織、植物神經紊亂等病變，為糖尿病較為常見的并發(fā)癥之一［1］，其有著較高的致殘致死率，研究發(fā)現(xiàn)約有70%～80%的糖尿病患者最終死于心血管并發(fā)癥［2］。SCN5A 基因編碼Na+通道的成孔亞單位，在控制心肌細胞的興奮傳導以及興奮維持方面起著重要作用。研究顯示［3?4］，SCN5A 基因的一些常見單核苷酸多態(tài)位點與心臟疾?。ㄈ缧呐K性猝死、單純性先天性心臟病、病態(tài)竇房結綜合征等）有關。目前研究的與心臟病變有關的SCN5A 的多態(tài)位點有H55R、P1090L、D1819D、C5457T 等［5］，但目前對于SCN5A 基因多態(tài)性與糖尿病心臟病變的關系研究報道相對較少，本研究旨在探討SCN5A 基因C5457T 位點與糖尿病心臟病變的關系，以期為臨床預防和治療糖尿病心臟病變提供一定的依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2013年4月至2015年4月于我院心內科門診及住院接受治療的T2DM 合并心臟病變患者102 例（T2DM+HD 組），其中男60 例，女42 例，糖尿病病程在10～19年，平均（14.69 ±4.22）年，年齡46～71 歲，平均（57.92±8.46）歲，所有研究對象均符合1999年世世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）有關糖尿病的診斷標準以及2013年歐洲心臟病學會心臟病變（糖尿病性心臟病包括冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，糖尿病性心肌病、微血管病變和自主神經功能紊亂所致的心律及心功能失常）的診斷標準［6］，采用調整后雙腔Simpson 法測得左室射血分數(shù)50%以上。排除標準：T1DM，合并有其他糖尿病并發(fā)癥，如糖尿病腎病、糖尿病足等；臨床診斷為繼發(fā)性高血壓、房顫或其他嚴重心律失常，中到重度瓣膜疾病、先天性心臟?。怀暀z查顯示靜息或負荷室壁運動出現(xiàn)異常及圖像質量顯示不理想；合并有嚴重的全身其他系統(tǒng)疾病，近期有重大外傷或手術治療者，出現(xiàn)高熱或者慢性感染者；可能影響心臟功能的非心臟疾病，如甲亢、貧血、慢性酒精中毒等。選取同期在我院門診、內分泌科住院，病程≤1年的單純T2DM 患者96 例（T2DM 組），其中男54 例，女42 例，年齡49～70 歲，平均（57.29±6.64）歲，單純T2DM 患者符合美國糖尿病協(xié)會（American Dia?betes Association，ADA）（2009年）和1999年WHO制定的有關T2DM 診斷標準，需要排除DPN、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病以及糖尿病血管病變患者；另選取同期在我院經體檢合格的健康人員60 例作為對照組（NC 組），男36 例，女24 例，年齡43～69 歲，平均（56.77 ± 8.42）歲。3 組對象在年齡、性別方面，差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05），數(shù)據(jù)具有可比性。3 組研究對象均簽訂知情同意書，并經醫(yī)院倫理委員會批準執(zhí)行。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 收集所有受試對象年齡、性別、T2DM 病程、心臟疾病病程、體質指數(shù)（body mass index，BMI）、血壓、心率、吸煙史（近1年內每周吸煙＞10 支）以及飲酒史。受試對象禁食8h，清晨空腹抽取肘靜脈血5 mL 用于檢測空腹血糖（fast?ing plasma glucose，F(xiàn)PG）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL?C）、高密度脂蛋白膽固醇（high?density lipoprotein cholesterol，HDL?C），均采用美國雅培C8000 全自動生化分析儀檢測、糖化血紅蛋白（HbA1c，ARKRAY HA8160 糖化血紅蛋白分析儀檢測），超敏C 反應蛋白（hypersensitive C?reactive protein，hs?CRP，免疫增強比濁法），游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA，酶比色法）。

1.2.2 左室功能檢測 受試對象取仰臥位，保持呼吸通暢，同步記錄心電圖（儀器為HP5500型彩色多普勒超聲診斷儀），探頭頻率為2.0～4.0 MHz。行常規(guī)二維超聲及血流多普勒檢測，心尖四腔心切面取樣容積主要位于二尖瓣瓣尖處，獲取二尖瓣血流頻譜圖，主要測量舒張早期峰值流速（early diastolic peak flow velocity，VE）、舒張晚期峰值流速（late dia?stolic peak flow velocity，VA）以及E 峰減速時間（E peak deceleration time，VEDT），計算VE/VA。心尖四腔心以及兩腔心采用雙腔Simpson法測量左室射血分數(shù)（ejection fraction，LVEF）、左心室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左室收縮末期內徑（left ventricular end systolic diam?eter，LVESD）、左心室后壁厚度（left ventricular poste?rior wall thickness，LVPWT）、室間隔厚度（interven?tricularseptal thickness，IVST）、左室心肌重量指數(shù)（left ventricular mass index，LVMI）。

1.2.3 PCR?RFLP 技術檢測SCN5A 基因C5457T位點多態(tài)性 空腹抽取受試對象肘靜脈血樣標本5 mL 置于含有EDTA 的EP 管中，采用傳統(tǒng)的酚?氯仿法提取樣本中DNA，保存于-80 ℃冰箱中備用，采用PCR?RFLP 技術檢測SCN5A 基因C5457T 位點多態(tài)性。引物以及探針經Primer Express 2.0 軟件進行設計，并經上海生工生物科技有限公司合成。上游引物序列：5′? CGCGTACGATCGCTGGC?TAGC ?3′，下游引物序列：5′? GGCGATCGACTA?AGTACGCTACTAC?3′，。PCR 擴增體系為25 μL，其中含有5 μL PCR 緩沖液，上游及下游引物各0.5 μL，5 U/L Taq DNA 聚合酶0.25 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 4.0 μL，剩余加入雙蒸水。SCN5A 基因C5457T 位點的擴增反應條件為：94 ℃預變性2 min，而后按照94 ℃30 s、59 ℃30 s、62 ℃15 s 的順序進行40 個循環(huán)，最后以62 ℃延伸1 min。PCR擴增產物長度為310 bp。所有樣本均在ABI?7500 fast RT?PCR 電泳儀上進行反應，抽取10%的樣本進行基因測序，從而確定基因分型檢測的準確性。

1.3 隨訪 所有糖尿病心臟病變患者均接受隨訪，隨訪截止時間為2018年5月1日，隨訪中位時間為13 個月，隨訪最長時間3年1 個月，隨訪方式為門診隨診、電話咨詢等方式，隨訪以患者出現(xiàn)心血管事件（指心源性死亡及因心臟相關疾病再次入院）或到隨訪截止時間為終點。

1.4 統(tǒng)計學方法 所得數(shù)據(jù)中符合正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組間采用兩個獨立樣本的t檢驗，3組基因型間采用單因素方差分析，組內比較采用LSD?t檢驗，非正態(tài)分布資料以中位數(shù)（四分位距）表示，采用秩和檢驗，計數(shù)資料以百分率表示，采用R×C χ2檢驗或Fisher 精確檢驗。群體基因型采用Hardy?Weinberg平衡檢驗。采用非條件的Logistic回歸分析檢測SCN5A基因C5457T位點與糖尿病心臟病變的遺傳效應之間的關系，并經多重檢驗P值的Bonferroni 對年齡、性別等干擾因素進行校正，采用Kaplan?Meier法進行生存分析，累積危險曲線比較采用Log Rank檢驗，所獲取數(shù)據(jù)均經SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包分析處理，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SCN5A 基 因C5457T 位 點 的PCR 產 物SCN5A 基因C5457T 位點酶切中呈現(xiàn)一條亮的且長度為310 bp 的條帶為TT 型；出現(xiàn)123 bp、177 bp、310 bp 三條亮帶的為CT 型，出現(xiàn)在123 bp、177 bp 兩條帶為CC 型。隨機選取SCN5A 基因C5457T 的PCR 擴增產物行基因測序，結果顯示堿基的改變與酶切結果一致（圖1）。

圖1 SCN5A 基因C5457T 位點的PCR 擴增及電泳圖Fig.1 PCR amplification and electrophoresis map of C5457T site in SCN5A gene

2.2 一般臨床資料結果比較 研究顯示，T2DM +HD 組、T2DM 組BMI、FPG、HbA1c、TG、HDL?C、hs?CRP、FFA，與NC 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。T2DM+HD組高血壓史、HbA1c、TG、LDL?C、HDL?C、hs?CRP、FFA、VE/VA、IVST、LVMI、LVEF、LVEDD，與T2DM 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組受試者一般臨床資料結果比較Tab.1 Comparison of general clinical data between groups ±s

表1 各組受試者一般臨床資料結果比較Tab.1 Comparison of general clinical data between groups ±s

注：與NC 組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與T2DM 組比較，△P＜0.05，☆P＜0.01

組別NC 組T2DM 組T2DM+HD 組F 值P 值HbA1c（%）5.01±0.48 6.82±0.86*8.96±0.94#△9.866 0.004 TC（mmol/L）4.39±0.67 4.69±0.73 4.77±0.75 0.297 0.786 TG（mmol/L）1.46±0.27 2.98±0.34*4.86±0.72#☆11.997 0.030 LDL?C（mmol/L）2.19±0.59 2.79±0.63 3.37±0.81*△7.224 0.018 HDL?C（mmol/L）1.52±0.29 1.14±0.21*0.83±0.19#△7.521 0.017 hs?CRP（mg/L）2.64±0.51 5.96±0.64#8.99±0.76#☆13.515 0.000 FFA（mmol/L）0.73±0.24 1.36±0.29*1.88±0.42#△11.952 0.000組別NC T2DM T2DM+HD F/χ2值P 值性別（男/女）36/24 54/42 60/42 0.134 0.714年齡（歲）56.77±8.42 57.29±6.64 57.92±8.46 0.366 0.628 BMI（kg/m2）23.74±2.69 25.94±2.51*25.97±3.03*5.032 0.043高血壓病史［例（%）］12（20.00）25（26.04）50（49.02）#☆11.097 0.003吸煙史［例（%）］37（61.67）59（61.46）65（63.73）0.109 0.742 FPG（mmol/L）5.27±0.61 8.26±0.91#8.64±1.03#8.997 0.010組別NC T2DM T2DM+HD F 值P 值VE/VA 0.74±0.08 0.79±0.010 0.51±0.08*△5.435 0.039 IVST（mm）11.12±1.14 12.09±1.21 18.06±1.38*△10.262 0.001 LVMI（g/m2）132.54±29.81 136.94±30.54 178.33±34.63*△9.882 0.004 LVEF（%）64.51±4.47 61.94±5.22 51.68±6.84*△6.881 0.024 LVEDD（mm）50.26±4.27 49.87±4.31 42.58±4.72*△6.822 0.026 LVESD（mm）38.64±5.74 39.84±5.44 40.21±6.10 1.101 0.147 LVPWT（mm）12.49±0.80 11.98±0.91 11.68±0.97 1.921 0.122

2.3 SCN5A 基因C5457T 位點基因型分布 研究顯示，3 組研究對象SCN5A 基因C5457T 位點基因型及C、T 等位基因頻率符合Hardy?Weinberg 遺傳平衡定律，說明符合群體代表性。T2DM + HD 組TT基因型、T等位基因頻率高于NC組、T2DM組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=20.678、23.135、9.677、10.747，P＜0.01）；T2DM組T等位基因頻率與NC組差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.468，P＜0.05），見表2。

表2 SCN5A 基因C5457T 位點基因型分布情況比較Tab.2 Comparison of genotype distribution of C5457T loci in SCN5A gene 例（%）

2.4 糖尿病心臟病變的回歸分析 以T2DM+HD作為因變量（是為1，否為0），以T2DM + HD 組與NC 組之間差異有統(tǒng)計學意義的指標作為自變量行Logistic回歸分析，高血壓史、HbA1c、TG、HDL?C、hs?CRP、FFA、IVST、LVMI 為T2DM + HD 的影響因素（表3）。

表3 糖尿病心臟病變的Logistic 回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis of diabetic heart disease

2.5 不同基因型臨床生化指標表達結果 研究顯示，TT 型患者TG、LDL?C、HbA1c、hs?CRP、FFA、IVST、LVMI，與CC型、CT型比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或P＜0.01），CT 型患者hs?CRP、FFA，與CC型比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

2.6 糖尿病心臟病變不同基因型患者隨訪分析 通過隨訪研究發(fā)現(xiàn)，TT型患者出現(xiàn)心血管事件累積發(fā)生風險與CC型、CT型患者比較，差異有統(tǒng)計學意義（Log χ2=5.586、4.763，P=0.015、0.027），見圖2。

3 討論

糖尿病心臟病變是T2DM 較為常見的心血管并發(fā)癥之一，與心肌代謝紊亂、心肌細胞纖維化、微血管內皮功能損傷以及自主神經病變等有密切關系，臨床表現(xiàn)可從無癥狀發(fā)展至嚴重的心律不齊、急性心肌梗死、心力衰竭乃至心源性死亡等［7］。目前，有研究認為導致糖尿病心臟病變的危險因素主要包括高齡、女性、遺傳因素、血糖、血脂代謝紊亂、高血壓、高胰島素血癥等［8］。為了進一步闡明影響糖尿病心臟病變的危險因素，我們將納入的102 例糖尿病心臟病變患者行Logistic 回歸分析，結果顯示，高血壓史、HbA1c、TG、HDL?C、hs?CRP 等均為糖尿病心臟病變的危險因素，提示高血壓、血糖控制水平、血脂異常以及炎癥反應均有可能導致糖尿病心臟病變的發(fā)生。

人類SCN5A 基因為電壓門控Na+通道基因家族中的一員，位于染色體3P21，編碼電壓門控性Na+通道基因，含有4 組同源結構域，含有28 個外顯子［9］。研究發(fā)現(xiàn)［10?11］，SCN5A 基因變異不僅能夠導致心律失常性疾病，如長QT 綜合征、特發(fā)性室顫以及心臟傳導阻滯等相關疾病，而且SCN5A 基因不同位點單核苷酸多態(tài)性與心臟Na+通道疾病有關。目前研究的與心臟病變有關的SCN5A 的多態(tài)位點有H55R、P1090L、D1819D、C5457T 等，但目前對于SCN5A 基因多態(tài)性與糖尿病心臟病變的關系研究報道相對較少，通過本研究發(fā)現(xiàn)，SCN5A 基因C5457T 位點存在基因分型、等位基因頻率分布差異，糖尿病心臟病變患者TT 型、T 等位基因頻率顯著高于單純T2DM 患者、NC 組人員，提示該基因位點可能為糖尿病心臟病變的易感基因。為了分析探討糖尿病心臟病變患者不同基因分型之間是否存在臨床生化指標表達差異，本研究進一步統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)TT 型 患 者TG、LDL?C、HbA1c、hs?CRP、FFA、IVST、LVMI高于CC型、CT型患者，表明SCN5A 基因C5457T 位點不同基因分型之間存在臨床生化指標表達及左室功能異常差異。值得注意的是，目前對于糖尿病心臟病變遠期心血管事件的研究分析較少。本研究發(fā)現(xiàn)，TT 型患者遠期發(fā)生心血管事件的累積危險發(fā)生率明顯高于CC型，筆者認為可能與TT 型患者血脂、心室功能異常程度更高存在因果關系。同時，早期的研究［10］已證實SCN 5A 基因的變異與多種嚴重心律失常關系密切，而CC 基因型為保護型，但CC 型是否單純通過改善血脂、心功能和心律失常發(fā)揮心血管保護作用，有待進一步探索。

表4 不同基因型臨床生化指標表達結果Tab.4 Expression of clinical and biochemical indexes of different genotypes ±s

表4 不同基因型臨床生化指標表達結果Tab.4 Expression of clinical and biochemical indexes of different genotypes ±s

注：與CC 基因型比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與CT 基因型比較，△P＜0.05

基因型Genotypes CC CT TT F 值P 值VE/VA 0.53±0.09 0.53±0.010 0.50±0.08 0.435 0.639 IVST（mm）15.68±0.94 16.36±0.61 19.27±0.57*△8.262 0.018 LVMI（g/m2）159.94±21.97 167.52±20.69 192.33±22.49*△9.882 0.004 LVEF（%）54.47±3.28 52.63±3.22 49.79±3.17 1.881 0.133 LVEDD（mm）43.41±3.74 42.19±3.39 41.63±3.42 2.042 0.102 LVESD（mm）39.86±6.14 39.42±6.63 41.83±5.97 1.101 0.147 LVPWT（mm）11.99±0.92 11.03±0.96 10.97±0.92 1.921 0.122基因型CC CT TT F 值P 值TG（mmol/L）3.69±0.96 3.82±0.98 5.13±0.89#△11.443 0.000 TC（mmol/L）4.66±0.86 4.74±0.92 4.91±0.90 1.098 0.104 LDL?C（mmol/L）2.88±0.65 3.03±0.41 3.52±0.43*△8.993 0.017 HDL?C（mmol/L）0.87±0.19 0.82±0.14 0.80±0.13 0.232 0.781 HbA1c（%）8.13±0.67 8.62±0.74 9.61±0.61*△8.138 0.019 FPG（mmol/L）8.53±0.61 8.62±0.64 9.16±0.67 1.288 0.142 hs?CRP（mg/L）6.34±0.51 8.44±0.61*9.32±0.53#△23.524 0.000 FFA（mmol/L）1.14±0.51 1.51±0.49*1.96±0.50#△17.824 0.000

圖2 Kalplan?Meier 法分析不同基因型患者心血管事件累積危險曲線Fig.2 Cumulative risk curves Kalplan?Meier analysis of cardiovascular events in patients with different genotypes

需要指出的是，目前研究證實無明顯心臟病變的無癥狀糖尿病患者可能已經存在左心室功能異常［12］，因此及時對糖尿病患者進行生活方式調整和藥物干預有助于減少糖尿病心衰的發(fā)生。臨床有研究顯示［13］，早期心臟功能受累的糖尿病患者均存在早期舒張、收縮功能異常。目前普遍認為糖尿病心臟變與代謝異常、心肌纖維化、心肌細胞肥大等有一定關系［14］。本研究顯示，糖尿病心臟病變組VE/VA、IVST、LVMI、LVEF、LVEDD，與T2DM 組、NC 組比較差異有統(tǒng)計學意義，采用Lo?gistic 回歸分析顯示，IVST、LVMI 為糖尿病心臟病變的影響因素。長期的全身小動脈血管腔狹窄是導致周圍血管阻力升高進而引起左心室肥厚的重要原因，而左心室肥厚能引發(fā)心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，研究顯示血脂異常與IVST、LVMI 等指標相關［15］，血脂代謝異常也是導致左心室肥厚的重要影響因素之一。因此，筆者認為糖尿病患者血脂代謝異常引起全身小動脈血管狹窄、導致糖尿病患者左心室肥厚，進而引起糖尿病心臟病變。但需要指出的是，血脂代謝是如何導致糖尿病患者左心室功能變化有待進一步研究。通過基因多態(tài)性分析也顯示，TT 基因型TG、LDL?C、FFA 等血脂指標以及IVST、LVMI 等左心室功能指標與CT、CC型比較差異有統(tǒng)計學意義，這在一定程度上說明不同基因型血脂代謝不盡相同，這對于課題組后續(xù)進一步研究糖尿病心臟病變以及藥物干預有一定的研究意義。

綜上，SCN5A 基因多態(tài)性為糖尿病心臟病變患者左室功能障礙易感基因，其可能與血脂代謝異常相關。