古輝 徐小彭 黃國華 李雪平 陳少立

佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院呼吸內科（廣東佛山528500）

慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmo?nary disease ，COPD）是老年人中最常見的呼吸系統(tǒng)慢性疾病之一，也是導致全球老年人死亡的主要疾病之一［1］。越來越多的證據(jù)表明，嗜酸性粒細胞性COPD 是該疾病的一種獨特表型，其特征是惡化風險較高但吸入糖皮質激素治療反應較好［2］。與老年人相比，COPD 受試者痰中嗜酸性粒細胞百分比和嗜酸性粒細胞陽離子蛋白濃度顯著增高，并且在疾病惡化期間，其氣道嗜酸性粒細胞數(shù)量進一步增加［3］。既往研究［4］數(shù)據(jù)顯示，37.4%的COPD 患者表現(xiàn)出持續(xù)的血液嗜酸性粒細胞計數(shù)大于或等于2%。血液嗜酸性粒細胞計數(shù)增高的非過敏性COPD 患者其特征是氣道嗜酸性粒細胞數(shù)量顯著增加，痰中白細胞介素（IL）?5 和觸珠蛋白水平升高，伴隨著顯著的氣道重塑，其支氣管肺泡灌洗液（BAL）中的趨化因子CCL20 和CCL24 濃度也顯著增高，表明這種嗜酸性粒細胞在COPD 的炎癥和氣道重塑過程中發(fā)揮重要的作用［5］。

白細胞介素33（interleukin 33，IL?33）主要由上皮細胞產(chǎn)生，是應答細胞外各種病變而產(chǎn)生的警報性因子之一［6］。最近的研究［7］表明，IL?33 在IL?5 之前調節(jié)嗜酸性粒細胞的作用，是嗜酸性粒細胞維持穩(wěn)態(tài)所必需的關鍵細胞因子。IL?33 可以激活并增強造血祖細胞（hemopoietic progenitor cells，HPC）的成熟。HPC 被認為是過敏性哮喘中的先天效應細胞［8］：它們產(chǎn)生大量的促炎細胞因子，并在炎癥部位的“原位造血”過程中分化為成熟的嗜酸性粒細胞，但目前對于IL?33 其與COPD患者中氣道嗜酸性粒細胞的關系仍未明確。呼出氣冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）中存在大量的介質因子，其能反應呼吸道中各種病理變化，并有望成為呼吸疾病新的生物標記物重要來源標本。本研究旨在探討COPD 患者中呼出氣冷凝液中IL?33 的表達水平，并探討其與COPD 患者中嗜酸性粒細胞以及炎癥程度之間的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2017年9月至2018年7月于我院就診的COPD 患者共60 例，納入標準：（1）符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南》［9］的診斷標準；（2）年齡不限；（3）獲得患者知情同意并簽署知情同意書。排除標準：（1）合并機體免疫性疾病的患者；（2）合并惡性腫瘤；（3）合并支氣管哮喘、擴張、肺結核的患者；（4）合并急性心肌梗死的患者；（5）近1 個月內采用免疫抑制劑或激素治療的患者；（6）合并全身炎癥反應及內分泌疾病的患者。選擇同期年齡相近的健康體檢者共50 例作為對照組，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核并批準。

1.2 檢測指標和方法 （1）呼出氣冷凝液的收集和保存：所有參與者采用便攜式呼出氣冷凝液收集器收集呼出氣冷凝液，在收集之前充分讓患者了解操作流程。囑托患者收集前先采用蒸餾水漱口，充分清理口腔中的食物殘渣和分泌物；收集時讓患者做平靜呼吸，收集時間為20 min，在收集期間注意冷凝管溫度的穩(wěn)定性。將收集到的冷凝液存儲于2 mL 的冷凍管，并在收集完30 min 后放-80 ℃冰箱進行保存以待檢測。（2）血液樣本的收集：所有參與者清晨空腹抽取靜脈全血，置于真空抗凝管保存，經(jīng)3 000 r/min 離心后，取血清保存于-80 ℃冰箱進行保存以待檢測。（3）ELISA 檢測：檢測冷凝液中的IL?33 的表達水平，同時檢測血清的IL?33、IL?6、IL?8、TNF?α的水平，所有試劑盒購自R&D SYSTEM，嚴格按照說明書的步驟規(guī)范操作。（4）氣道嗜酸性粒細胞檢測：所有COPD 患者健康受試者通過氣道霧化收集痰液，經(jīng)過消化并過濾后，將過濾液在離心后固定采用HE 染色，對標本在鏡下進行觀察計數(shù)，記錄嗜酸性粒細胞的比例。

1.3 臨床指標記錄 記錄所有COPD 患者和參與者的基本資料，包括年齡、性別、BMI、是否為穩(wěn)定期或AECOPD；記錄所有COPD 患者的肺功能檢測指標，根據(jù)肺功能檢測采用GOLD 分級系統(tǒng)對肺功能進行分級，記錄所有患者的血常規(guī)中的嗜酸性粒細胞水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0 進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)± 標準差表示，比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用SNK 法檢驗；計數(shù)資料采用百分比表示，比較采用卡方檢驗，兩指標的相關性評估采用Spearman 相關分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 兩組患者的平均年齡、性別比例和平均BMI 比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），60 例COPD 患者其平均病程為（4.2 ± 1.8）年，其中處于COPD穩(wěn)定期的39例，急性加重期的21 例，GOLD 分級Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別為21、28、11 例（表1）。

表1 兩組患者的一般情況比較Tab.1 Comparison of general conditions between the two groups of patients±s，例

表1 兩組患者的一般情況比較Tab.1 Comparison of general conditions between the two groups of patients±s，例

臨床項目年齡（歲）性別（男/女）BMI(kg/m2)病程（年）分期（穩(wěn)定期/AECOPD）GOLD 分級(Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ)COPD 組（n=60）67.2±5.7 34/26 23.1±1.9 4.2±1.8 39/21 21/28/11對照組（n=50）65.6±7.3 31/19 22.8±2.3- - -t/χ2值t=1.290 χ2=0.321 t=0.749- - -P 值0.200 0.571 0.455- - -

2.2 兩組患者其IL?33 及相關臨床指標對比 其中COPD 組的平均呼出氣冷凝液IL?33 水平為（3.1±0.6）pg/mL，顯著高于對照組的（1.4±0.5）pg/mL，差異具有統(tǒng)計學意義（t=15.943，P＜0.05）；且COPD 組的平均氣道嗜酸性粒細胞比例、血嗜酸性粒細胞比例、血清IL?33、IL?6、IL?8 和TNF?α水平均顯著高對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中COPD 組的平均FEV1/FVC 為（56.7 ± 6.8）%（表2）。

表2 兩組患者的相關臨床指標比較Tab.2 Comparison of relevant clinical indicators between the two groups of patients±s

表2 兩組患者的相關臨床指標比較Tab.2 Comparison of relevant clinical indicators between the two groups of patients±s

臨床參數(shù)冷凝液IL-33（pg/mL）氣道嗜酸性粒細胞（%）血嗜酸性粒細胞（%）血清IL-33（pg/mL）IL-6（pg/mL）IL-8（pg/mL）TNF-α（pg/mL）FEV1/FVC（%）COPD 組（n=60）3.1±0.6 3.4±0.7 4.3±1.9 35.2±7.4 193.1±41.5 52.5±21.1 74.7±24.5 56.7±6.8對照組（n=50）1.4±0.5 0.9±0.2 2.5±1.3 22.6±5.5 108.1±32.3 10.6±4.5 16.9±8.6-t 值15.943 24.420 5.680 9.961 11.804 13.773 15.877-P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001-

2.3 不同嚴重程度COPD 患者的呼出氣冷凝液IL?33 水平對比 其中AECOPD 的COPD 患者呼出氣冷凝液IL?33 水平顯著高于穩(wěn)定期的患者，差異具有統(tǒng)計學意義（t=17.268，P＜0.001），且不同GOLD 分級COPD 患者的呼出氣冷凝液IL?33 水平對比差異具有統(tǒng)計學意義（F=5.127，P=0.004），其中GOLD 分級Ⅳ級的呼出氣冷凝液IL?33 水平顯著高于Ⅱ級和Ⅲ級，GOLD 分級Ⅲ級的顯著高于Ⅱ級，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同分期和GOLD 分級COPD 患者的呼出冷凝液IL?33 水平比較Tab.3 Comparison of exhaled lysate IL?33 levels in COPD patients with different stages and GOLD grade ±s

表3 不同分期和GOLD 分級COPD 患者的呼出冷凝液IL?33 水平比較Tab.3 Comparison of exhaled lysate IL?33 levels in COPD patients with different stages and GOLD grade ±s

指標分期穩(wěn)定期AECOPD GOLD 分級Ⅱ級Ⅲ級Ⅳ級例數(shù)39 21 21 28 11冷凝液IL?33（pg/mL）2.7±0.3 4.7±0.6 2.9±0.3 3.4±0.5 4.3±0.5 t/F 值17.268 5.127 P 值＜0.001 0.004

2.4 呼出氣冷凝液IL?33 水平與嗜酸性粒細胞及炎癥因子的相關性 60 例COPD 患者呼出氣冷凝液IL?33 水平與血清IL?33、氣道嗜酸性粒細胞比例、血嗜酸性粒細胞比例、IL?6、IL?8 和TNF?α呈顯著的正相關（P＜0.05），呼出氣冷凝液IL?33 水平與肺功能指標中的FEV1/FVC 呈顯著的負相關（r＝?0.392，P＝0.002）（表4）。

表4 呼出氣冷凝液IL?33 水平與各項指標的相關性分析Tab.4 Correlation analysis of IL?33 level of exhaled condensate and various indicators（n=60）

3 討論

呼出氣冷凝液（EBC）有望成為肺部疾病新的生物標志物的重要來源。EBC 可以被認為是體液或呼出氣體的冷凝物，能反映氣道中呼吸道液體成分的變化［10］。研究表明，EBC 中可能包含過氧化氫、蛋白質、細胞因子，類二十烷酸，和大分子如粘蛋白，磷脂和DNA 等一系列成分和因子。在疾病狀態(tài)中，EBC 含有反映該疾病的分子或更高濃度的特定標記物。例如，患有胃食管反流病的患者在其EBC 中已被證實患有胃蛋白酶。已經(jīng)有研究證實COPD 和哮喘患者在支氣管激發(fā)后在EBC中的活性氧水平和組胺水平顯著升高。

IL?33 是IL?1 家族的新成員，由于其在免疫應答中的功能而引起了極大的關注。它主要在各種炎癥中的細胞和組織表達。免疫細胞，巨噬細胞和樹突細胞均可以在特定的刺激下產(chǎn)生IL?33［11］。已知IL?33 是ST2 的配體，并且在免疫應答和炎性疾病中起重要作用。除了Th2 型免疫反應外，最近的研究表明，IL?33 通過促進自然殺傷和自然殺傷T 細胞分泌Th1 型細胞因子，對Th1 型反應有顯著影響。 IL?1 受體相關蛋白ST2 和IL?1 受體輔助蛋白（IL?1RAcP）是IL?33 介導的信號轉導所必需的受體，研究表明，在病變的肺組織中可檢測到高表達水平的IL?33，表明IL?33 其在呼吸系統(tǒng)疾病中起重要作用。既往研究［12］已經(jīng)顯示雖然已報道COPD 患者的血清ST2 和IL?33 水平升高，但EBC中的IL?33 在COPD 的表達水平和與臨床疾病關系仍未明確。高達40%的慢阻肺患者中發(fā)現(xiàn)類似哮喘患者的嗜酸粒細胞的氣道炎癥，雖然研究［13］表明嗜酸性粒細胞可能通過參與自身免疫失衡而參與慢阻肺的病理生理進程，但對于COPD 中嗜酸性粒細胞的功能仍未明確。本研究中，明確了在COPD 患者中EBC 中的IL?33 水平顯著增高，且與氣道誘導痰的嗜酸性粒細胞比例以及血清多項炎癥因子水平呈顯著的正相關，表明了IL?33 參與了COPD 的炎癥反應，并潛在參與COPD 患者嗜酸性粒細胞的激活。

既往有研究通過檢測到肺組織的IL?33 表達水平顯著增高，表明IL?33 上調可能參與系統(tǒng)性炎癥和COPD 氣道炎癥［14］。本研究采用ELISA 法檢測了COPD 和健康參與者的EBC 中的IL?33 表達水平，結果顯示了COPD 患者其EBC 中的IL?33 水平顯著升高，且IL?33 表達水平與COPD 患者的分期和分級情況密切相關，這也從另一種檢測手段確認了IL?33 參與COPD 患者的機體發(fā)病機制。本研究中也檢測了所有參與者中的血清IL?33 表達水平，且血清IL?33 與EBC 中的IL?33 表達水平相關系數(shù)達到了0.778，表明了EBC 的IL?33 表達水平能反映患者血清的IL?33 表達水平。同時，對血清檢測的進一步結果顯示其IL?6、IL?8 和TNF?α水平均顯著升高，同時氣道中嗜酸性粒細胞比例也顯著升高，這與既往研究結果相一致。既往研究顯示，在呼吸道刺激物刺激下，IL?33 和ST2 在小鼠肺組織中顯著高表達，其伴有中性粒細胞和巨噬細胞滲透增多，顯示了IL?33 是氣道炎癥中的細胞因子和趨化因子。且研究［15］結果證明了EBC 中的IL?33 蛋白是可檢測的，EBC 中的IL?33 水平與氣道嗜酸性粒細胞比例、IL?6、IL?8 和TNF?α呈顯著的正相關證明了氣道EBC 能良好地反應COPD 患者的全身炎癥指標狀態(tài)。有研究顯示IL?33 可以通過ST2 受體促進COPD 患者的IL?6 和IL?8 的產(chǎn)生參與早期的抗炎調節(jié)機制。COPD 患者氣道中嗜酸粒細胞增多，且嗜酸性粒細胞中也存在ST2 的表達，因此，IL?33 可通過ST2 激活嗜酸性粒細胞導致產(chǎn)生超氧化物和IL?8等炎癥因子，維持嗜酸性粒細胞存活。這可能是IL?33與氣道嗜酸性粒細胞呈顯著正相關的主要原因。因此，針對嗜酸性粒細胞在COPD 的重要作用，通過抑制IL?33 介導的嗜酸性粒細胞激活有可能成為控制COPD 患者炎癥進展的重要途徑，但對于氣道中IL?33 具體介導嗜酸性粒細胞激活的機制仍需要進一步深入研究。

綜合上述，本研究結果表明了COPD 患者呼出氣冷凝液IL?33 的表達水平顯著增高，氣道IL?33參與了COPD 患者的病情進展，且與氣道和外周血中的嗜酸性粒細胞比例及血清IL?6、IL?8 和TNF?α水平顯著相關。