陳燕玲 羅婷 高昕樂 許志威 凡棟 吳秀香 靳俊峰 王智趙曉朵 莊曉東

1遵義醫(yī)科大學珠海校區(qū)病理生理學教研室（廣東珠海519041）；2中山大學北校區(qū)中山醫(yī)學院（廣州510080）；3遵義醫(yī)科大學珠海校區(qū)病理學教研室（廣東珠海519041）；4中山大學附屬第一醫(yī)院心血管內科（廣州510080）

造影劑腎病是指靜脈注射造影劑后48～72 h內出現(xiàn)血清肌酐值升高≥0.5 mg/dL 或血清肌酐水平相對升高≥25%，并且排除其他原因引起的急性腎功能損傷［1］。造影劑腎病是醫(yī)源性急性腎功能損傷的第三大主因，雖然隨著含碘造影劑安全性的改進以及采取水化、抗氧化劑等預防措施后，造影劑腎病的發(fā)生率已經有所下降。但由于依賴造影劑的診療操作不斷增加，其潛在的危害仍不容忽視。關于造影劑腎病的發(fā)病機制目前尚未完全闡明，但是很多學者認為造影劑腎病的發(fā)生與造影劑對腎小管細胞的直接和間接毒性作用有關［2］。造影劑可誘導腎小管上皮細胞損傷及凋亡，但具體的信號通路還不是十分清楚。本實驗以HK?2 細胞作為研究對象，觀察碘普羅胺對HK?2細胞凋亡及Klotho/ Wnt/β?catenin 信號通路的影響，探討造影劑引起腎小管上皮細胞凋亡的可能機制，為臨床治療造影劑腎病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑來源 HK?2 細胞株由中山大學王蔚東教授提供；胎牛血清、碘普羅胺（碘濃度為370 mgI/mL）、DAPI、CCK?8 檢測試劑盒分別購自美國Gibco 公司、拜耳醫(yī)藥保健有限公司、美國Sigma公司及日本同仁化學研究所；一抗：Bax、Bcl?2、Cleaved?caspase?3、Wnt、p?β?catenin、β?catenin、GAPDH 及辣根過氧化物標記山羊抗兔Ⅱ抗均為美國Cell Signaling Technology 公司產品。Klotho 一抗為上海Absin 公司產品。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 HK?2 細胞用DMEM/F12培養(yǎng)基（內含10%胎牛血清）培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天傳代一次，取處于對數(shù)生長期并且狀態(tài)良好的細胞進行后續(xù)實驗。實驗分為五組，分別為正常對照組、37、74、111 及148 mgI/mL 碘普羅胺組。濃度梯度設置參考以往的文獻報道［3］。

1.3 CCK?8 細胞活力的檢測 取對數(shù)生長期的HK?2 細胞接種于96 孔板，對照組加入正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，各碘普羅胺處理組分別給予不同濃度的碘普羅胺（37、74、111、148 mgI/mL）處理，同時設置空白組（在96孔板中直接加入培養(yǎng)基），每組設置5個復孔，藥物處理24 h 后棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 內含10%CCK?8的無血清培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，酶標儀檢測各樣品在450 nm處的吸光度值（OD值）。細胞存活率=（處理組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.4 DAPI 染色觀察細胞核形態(tài) 將HK?2 細胞按照3×107個/L 的密度均勻接種于6 孔培養(yǎng)板內，按照上述實驗分組加入不同濃度的碘普羅胺處理24 h 后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛進行固定，固定10 min 后，PBS 洗3 次，每孔加入1 mL 濃度為1 μg/L 的DAPI 染色液，37 ℃避光孵育20 min 后，吸出DAPI 染色液，PBS 洗3 次，用日本奧林巴斯公司的熒光顯微鏡觀察并拍照，每組隨機選取五張照片，計算各組細胞的凋亡率。

1.5 Western Blot法檢測HK?2細胞中Bax、Bcl?2、Cleaved?caspase?3、Klotho、Wnt、p?β?catenin、β?catenin 蛋白表達水平 HK?2 細胞經不同濃度的碘普羅胺處理24 h 后倒掉培養(yǎng)液，用預冷的PBS洗3 遍，盡量吸走殘余的PBS，每皿加入200 μL 混有PMSF 的RIPA 細胞裂解液（強）提取細胞總蛋白（RIPA 裂解液與PMSF 的比例為1∶1 000），冰上裂解20 min，然后將蛋白收集到1.5 mL 的EP 管中，13 255 g 離心10 min 后取上清，BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，每組取60 μg 蛋白，加入上樣緩沖液混勻（蛋白與上樣緩沖液體積之比為1∶4），100 ℃加熱5 min，進行SDS?PAGE 電泳。電泳條件：前30 min，80 V 恒壓，后60 min，100 V 恒壓。轉膜條件：200 mA 恒流，60 min（Klotho 蛋白轉膜時間為150 min，β?catenin 蛋白轉膜時間為120 min）。轉膜完畢后，在室溫下用5%TBST 脫脂奶粉溶液將轉膜后的PVDF 膜封閉60 min。然后加入一抗，Bax、Bcl?2、Cleaved?caspase?3、Klotho、Wnt、p?β?catenin、β?catenin、GAPDH 一抗滴度均為1∶1 000，4 ℃冰箱內孵育過夜。一抗孵育完畢后，TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入二抗室溫孵育60 min，TBST 洗膜3 次，每次10 min，二抗滴度為1∶5 000。在暗室中加入ECL 發(fā)光液膠片顯影或使用美國Analytik Jena 公司的成像儀掃描目的條帶，再用ImageJ 軟件對條帶灰度值進行半定量分析，并與同組GAPDH 條帶的灰度值相比，確定各組之間的差異。

1.6 統(tǒng)計學方法 正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據進行分析，組間比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA），組間均數(shù)比較采用LSD?t法，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 碘普羅胺對HK?2 細胞存活率的影響 為檢測碘普羅胺對HK?2 細胞增殖的影響，本研究設置37、74、111、148 mgI/mL 不同濃度的碘普羅胺處理組，以CCK?8 法檢測HK?2 細胞的存活率。結果顯示，對照組及37、74、111、148 mgI/mL 碘普羅胺處理組細胞存活率分別為（100 ± 2.17）%、（93.61 ±1.89）%、（74.65 ± 3.36）%、（65.22 ± 2.36）%、（48.97± 2.73）%。不同濃度的碘普羅胺處理組細胞存活率均較對照組降低，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 碘普羅胺對HK?2 細胞細胞活力的影響Fig.1 Effect of iopromide on cell viability of HK?2 cells

2.2 碘普羅胺對HK?2 細胞凋亡率的影響 DAPI染色后于熒光顯微鏡下觀察，可見碘普羅胺處理組的部分細胞細胞核密度明顯增高，出現(xiàn)明顯的核固縮或核分裂等凋亡特征，見圖2。并且經統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，對照組細胞凋亡率為（1.78 ± 0.10）%，碘普羅胺處理組細胞凋亡率分別為（7.32 ± 2.34）%、（9.18±2.10）%、（14.19±2.39）%、（20.68±4.69）%，碘普羅胺處理組細胞凋亡率均比對照組升高（P＜0.05），見圖3。

2.3 碘普羅胺對HK?2 細胞Bcl?2 及Bax 蛋白表達的影響 與對照組相比，37mgI/mL 碘普羅胺組Bax/Bcl?2 比值雖然較對照組增高，但差異無統(tǒng)計學意義。其余濃度的碘普羅胺組Bax/Bcl?2 比值均較對照組升高，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖2 顯微鏡觀察各組細胞細胞核形態(tài)的變化（×400）Fig.2 The changes in nuclear morphology of cells in each group observed by Microscopic（×400）

圖3 碘普羅胺對HK?2 細胞凋亡率的影響Fig.3 Effect of iopromide on the apoptosis rate of HK?2 cells

2.4 碘普羅胺對HK?2 細胞Cleaved?caspase?3 蛋白表達的影響 與對照組相比，不同濃度的碘普羅胺處理24 h 后，Cleaved?caspase?3 蛋白表達均明顯增高，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5。

2.5 碘普羅胺對HK?2 細胞Klotho/Wnt/β?catenin信號通路蛋白表達的影響 與對照組相比，HK?2細胞經不同濃度的碘普羅胺處理24 后，Klotho 表達水平均降低，而Wnt、p?β?catenin 及β?catenin 蛋白表達水平均較對照組升高，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖6。

圖4 碘普羅胺對HK?2 細胞Bcl?2 及Bax 蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of iopromide on the expression of Bcl?2 and Bax in HK?2 cells

圖5 碘普羅胺對HK?2 細胞Cleaved?caspase?3 蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of iopromide on the expression of Cleaved?caspase?3 in HK?2 cells

2.6 NAC 對碘普羅胺誘導的HK?2 細胞Klotho/Wnt/β?catenin 信號通路蛋白表達的影響 與對照組相比，111 mgI/mL 碘普羅胺處理24 h 后，Klotho表達水平明顯降低，Wnt、p?β?catenin 及β?catenin蛋白表達水平明顯升高，而加入不同濃度的NAC后可以逆轉碘普羅胺對Klotho/Wnt/β?catenin 信號通路蛋白表達的影響（P＜0.05），見圖7。

3 討論

圖6 碘普羅胺對HK?2 細胞Klotho/Wnt/p?β?catenin 及β?catenin 蛋白表達水平的影響Fig.6 Effect of iopromide on the expression of Klotho/Wnt/p?β?catenin and β?catenin in HK?2 cells

圖7 NAC 對碘普羅胺誘導的HK?2 細胞Klotho/Wnt/p?β?catenin 及β?catenin 蛋白表達水平的影響Fig.7 Effect of NAC on the expression of Klotho/Wnt/p?β?catenin and β?catenin in HK?2 cells induced by iopromide

腎小管上皮細胞損傷是造影劑腎病發(fā)生的主要機制之一。在本實驗中，HK?2 細胞經不同濃度的碘普羅胺處理后，細胞活力明顯降低，細胞凋亡率明顯增高，說明碘普羅胺可誘導腎小管上皮細胞損傷。

Bcl?2家族及Caspase家族在細胞凋亡中具有重要作用。Bax蛋白表達上調或Bcl?2蛋白表達下調，導致Bax 與Bcl?2兩者之間的比例增高，可促進細胞凋亡的發(fā)生。Caspase?3作為執(zhí)行凋亡的重要蛋白，當其受到凋亡信號刺激時，可剪切為活化形式的Cleaved?caspase?3，Caspase?3 的激活可致細胞DNA斷裂，促進細胞凋亡［4］。本實驗中，HK?2 細胞經不同濃度的碘普羅胺處理后，Bax/Bcl?2 比值上調，Cleaved?caspase?3表達增高，細胞凋亡率明顯增加，說明碘普羅胺可誘導腎小管上皮細胞凋亡。

Klotho（編碼基因為KL）是一種與衰老相關的基因［5］。人類Klotho 基因編碼的蛋白包括膜型和分泌型Klotho 蛋白兩種形式，其中膜型Klotho 蛋白主要在腎臟表達［6］。近年來，研究［7］發(fā)現(xiàn)Klotho 蛋白的水平與腎功能密切相關。在腎臟出現(xiàn)功能障礙的早期，Klotho 蛋白的表達即開始發(fā)生變化。研究報道，在缺血再灌注損傷所導致的急性腎損傷模型小鼠中，再灌注3 h 后血漿及腎臟的Klotho 蛋白表達開始持續(xù)降低，而5 h 后血漿中的中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白、血肌酐才會出現(xiàn)輕度升高［8］。慢性腎臟病患者血清Klotho 水平隨腎功能下降而降低［9］。Klotho 蛋白還與細胞凋亡密切相關，通過轉基因使人臍靜脈內皮細胞過表達Klotho 蛋白后，內皮細胞內過氧化物的生成及脂質過氧化產物減少，細胞線粒體內MnSOD 水平升高，Caspase?3、Caspase?9 的活性降低，P53、P21 的表達下調，細胞凋亡數(shù)目減少［10］。

Wnt/β?catenin 信號通路廣泛存在于多細胞真核生物中，在胚胎發(fā)育過程中起重要作用，與腎臟疾病的發(fā)生密切相關。在單側輸尿管結扎及阿霉素誘導的慢性腎臟疾病模型小鼠中，研究發(fā)現(xiàn)TGF?β1 可以抑制Klotho 的表達，Klotho 的表達缺失，繼而激活β?catenin，最終導致腎臟損傷，Klotho可能是Wnt/β?catenin 內源性的拮抗劑［11］。Wnt/β?catenin 信號通路的激活可以促進細胞凋亡的發(fā)生，而阻斷Wnt/β?catenin 信號通路可減輕腎缺血再灌注所致慢性腎間質纖維化［12-13］。本實驗結果顯示，加入不同濃度的碘普羅胺處理后，HK?2 細胞Klotho 蛋白表達水平均明顯降低，Wnt、p?β?catenin及β?catenin 蛋白表達水平明顯升高，而加入臨床上常用的具有防治造影劑腎病作用的NAC后，可以逆轉碘普羅胺的上述效應［14-15］。筆者分析Klotho/Wnt/β?catenin 通路在碘普羅胺誘導的腎小管上皮細胞凋亡中具有重要作用，碘普羅胺可能通過抑制Klotho 蛋白表達，進而激活Wnt/β?catenin 信號通路，使Bax、Cleaved?caspase?3 表達上調，Bcl?2 表達下調，繼而誘導腎小管上皮細胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，碘普羅胺可誘導腎小管上皮細胞發(fā)生凋亡，其機制可能與其下調Klotho 蛋白表達，激活Wnt/β?catenin 信號通路有關。