徐婧玥 張賀平 李洪娟 馬曉芳 李艷霞 劉曉智

天津市第五中心醫(yī)院1檢驗(yàn)科，2中心實(shí)驗(yàn)室（天津300450）

肺癌是世界上病死率最高的惡性腫瘤之一，因治療效果差，術(shù)后易復(fù)發(fā)，其發(fā)病率和病死率呈持續(xù)上升趨勢(shì)［1-2］。隨著免疫治療與靶向治療的興起，尋找潛在基因及新的治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。WFDC2（WAP type four disulphide core protein 2）也稱(chēng)人附睪蛋白4（human epididymis protein 4）是一個(gè)新的基因，目前對(duì)HE4 的研究多集中于卵巢癌診斷方面，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)其與卵巢癌細(xì)胞侵襲、增殖及凋亡生物學(xué)行為密切相關(guān)［3-5］。隨著人們對(duì)該基因的認(rèn)識(shí)發(fā)現(xiàn)其在肺癌中也呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)［6-9］，但與肺癌發(fā)展機(jī)制的相關(guān)研究尚未明確。本文通過(guò)特異性小分子干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）技術(shù)，觀察沉默WFDC2 對(duì)肺癌細(xì)胞系增殖侵襲的影響，以期為肺癌的治療提供新的研究線索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人源性A549 細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。3條干擾序列分別為（1）siRNA?WFDC2a 5′?GCTCTCTGCCCAATGATAAGG?3′，（2）siRNA?WFDC2b 5′?GTGTCCTG?GCCAGATGAA?ATG?3′，（3）siRNA?WFDC2c 5′?GATGAAATGCTGCCGCAAT?GG?3′；siRNA 序列購(gòu)自南京生物有限公司；兔抗人多克隆HE4 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；兔抗人β?actin 單克隆抗體、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；細(xì)胞轉(zhuǎn)染用脂質(zhì)Lipofectamine2000（Invitrogen公司）；CCK8 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；胎牛血清為浙江天杭生物科技有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶及opti?MEM 培養(yǎng)基均購(gòu)自購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；transwell 小室購(gòu)自Corning 公司；Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、分組 液氮中取出細(xì)胞系A(chǔ)549、復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清的RPMI1640 完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6 孔板中，細(xì)胞密度約為60%時(shí)，按照LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)6 h 后更換含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。分組：（1）空白組：正常培養(yǎng)肺癌細(xì)胞系未做轉(zhuǎn)染（control）；（2）陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染非特異性siRNA（siR?neg）；（3）siRNA?WFDC2 組：轉(zhuǎn)染人WFDC2 序列特異性siRNA（siR?WFDC2）。

1.2.2 RT?PCR 檢測(cè)細(xì)胞mRNA 的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h 后，依據(jù)Trizol RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)分別對(duì)A549 各組細(xì)胞進(jìn)行總RNA 提取，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將其合成CDNA。進(jìn)行RT?PCR，上游引物序列5′?GCTGTTCGGCTTCACCCT?3′，下游引物序列5′?TGCGGCAGCATTTCATCT?3′，GAPDH 為內(nèi)參。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性50 s，65 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，30 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)平行管。

1.2.3 Western Blot 檢測(cè)細(xì)胞中蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h 后，提取總蛋白，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37 ℃，搖床40 min。然后，各組分別加入（1∶100）HE4 抗體，以（1∶1 000）β?actin 作為內(nèi)對(duì)照，4℃水平搖床過(guò)夜。次日1∶2 000 稀釋二抗室溫孵育1 h。膠片顯色后利用Gel Doc 1000 成像系統(tǒng)及分析軟件進(jìn)行圖像掃描和分析。

1.2.4 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中加入CCK8 試劑。每個(gè)細(xì)胞設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，一個(gè)空白孔（只加培養(yǎng)基），分別于0、1、2、3、4、5 d 各取一塊板，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的OD值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染48 h 的A549 細(xì)胞接種于6 孔板轉(zhuǎn)天長(zhǎng)滿(mǎn)進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，100 倍倒置熒光顯微鏡觀察記錄每組劃痕兩側(cè)初始距離，記為S0（每組隨機(jī)選取5 個(gè)點(diǎn)，做好標(biāo)記），無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后終止實(shí)驗(yàn)，再測(cè)量?jī)蓚?cè)細(xì)胞間距離S1。細(xì)胞遷移距離=S0-S1。

1.2.6 體外侵襲實(shí)驗(yàn) 將-20 ℃Matrigel 基質(zhì)膠置于4℃冰箱中過(guò)夜成液態(tài)，在Transwell 上室鋪膠，將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的各組細(xì)胞常規(guī)法用無(wú)血清培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液，取100 μL 細(xì)胞懸液（5 × 104個(gè)）加入Transwell小室，下室中加入500 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24、48 h 后，用棉簽小心擦去微孔膜內(nèi)層的細(xì)胞，固定，染色，PBS 洗兩次，附著于聚碳酯膜下表面的細(xì)胞在高倍鏡下（× 200）隨機(jī)觀察6 個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間經(jīng)單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后WFDC2 mRNA 和蛋白表達(dá) RT?PCR 和Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)siRNA?WFDC2 轉(zhuǎn)染后，A549 細(xì)胞中WFDC2 mRNA水平和蛋白表達(dá)較空白組（control）和陰性對(duì)照組（siR?neg）顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 細(xì)胞增殖情況 與空白組和陰性對(duì)照組相比，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，siRNA?WFDC2 組A549 細(xì)胞增殖能力顯著降低（P＜0.05）；control 組與siR?neg組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染后A549 細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，空白組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞遷移距離分別為（533.12±44.27）μm、（508.12±67.31）μm和（266.24 ± 55.02）μm，實(shí)驗(yàn)組與空白組和陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染后A549 細(xì)胞侵襲能力 Transwell 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種后的24 h 和48 h，實(shí)驗(yàn)組與空白組和陰性對(duì)照組相比細(xì)胞遷移數(shù)量顯著減少（P＜0.05）。見(jiàn)圖4，表1。

3 討論

WFDC2基因定位于人染色體20q12?13.1 上，全長(zhǎng)約12 kb，包含4 個(gè)內(nèi)含子和5 個(gè)外顯子，屬于乳酸清蛋白（WAP）家族成員，這一基因家族中研究較多的是分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制因子（SLPI）和彈性蛋白酶抑制劑（elafin），WAGENBLAST 等［10］研究提示SLPI是腫瘤血管擬態(tài)的驅(qū)動(dòng)因素，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其充當(dāng)抗凝劑作用可能會(huì)促使紅細(xì)胞進(jìn)入腫瘤及癌細(xì)胞進(jìn)入血液而導(dǎo)致腫瘤的增殖與擴(kuò)散；LU等［11］研究提示HE4 能直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞DNA 合成、調(diào)節(jié)PCNA和p21的表達(dá)。HE4含有2個(gè)高度保守的WAP 結(jié)構(gòu)域使其具有蛋白酶抑制劑的活性參與腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲等過(guò)程［12］。有研究表明HE4影響了上皮性卵巢癌細(xì)胞粘附、增殖、侵襲、遷移［13］，RIBEIRO 等研究提示［14］，HE4 在過(guò)表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系SKOV3 有更高水平的AKT3，因此認(rèn)為HE4 影響了P23K/AKT 通路途徑，而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力；也有研究顯示［15］HE4 能夠與EGFR、IGF1R 和轉(zhuǎn)錄因子HIF1α相互作用，促進(jìn)卵巢腫瘤的生長(zhǎng)；WFDC2 基因位點(diǎn)與各種惡性腫瘤表達(dá)有密切關(guān)系，目前文獻(xiàn)報(bào)HE4 作為血清腫瘤標(biāo)志物在肺癌的早期診斷及療效監(jiān)測(cè)有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值［16-17］，但WFDC2 在肺癌增殖遷移及侵襲及干擾WFDC2 基因的抑癌機(jī)制尚不明確。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)siRNA 轉(zhuǎn)染人肺癌A549細(xì)胞，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中HE4 蛋白及mRNA 表達(dá)量均下降，且對(duì)細(xì)胞增殖速度及細(xì)胞遷移率起到了抑制作用與ZHU［18］等在卵巢癌增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移研究中生物學(xué)行為一致，由此可見(jiàn)該基因可能在肺腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，提示W(wǎng)FDC2 基因有可能成為肺癌治療的新靶點(diǎn)，本次研究?jī)H選取了肺腺癌細(xì)胞系且只探討了WFDC2 在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，在今后的研究中應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)展到肺鱗癌及小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系及其對(duì)肺癌的侵襲、增殖中的具體作用機(jī)制，以期為肺癌的診斷、治療提供更有力的證據(jù)。

圖1 siRNA 對(duì)A549 細(xì)胞中WFDC2 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of siRNA on the expression of WFDC2 mRNA and protein in A549 cells

圖2 siRNA?WFDC2 對(duì)A549 細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of siRNA?WFDC2 on proliferation of A549 cells

表1 A549 不同組別24 h 及48 h 遷移細(xì)胞數(shù)量（個(gè)/視野）Tab.1 Number of cells migrating from different groups at 24 and 48 hours（per field of vision）±s

表1 A549 不同組別24 h 及48 h 遷移細(xì)胞數(shù)量（個(gè)/視野）Tab.1 Number of cells migrating from different groups at 24 and 48 hours（per field of vision）±s

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別空白組陰性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)量/24 h 45.71±8.44 50.98±6.24 28.48±7.94*遷移細(xì)胞數(shù)量/48 h 110.47±15.43 98.73±10.45 54.34±10.73*

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siR?WFDC2 轉(zhuǎn)染對(duì)A549 細(xì)胞遷移能力的影響Fig.3 Effect of siR?WFDC2 transfection on migration of A549 cells by scarification assay

圖4 Transwell 檢測(cè)siR?WFDC2 轉(zhuǎn)染對(duì)A549 細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.4 Effect of siR?WFDC2 transfection on invasion of A549 cells by Transwell assay

綜上所述，沉默WFDC2 基因后可有效抑制肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 增殖、遷移及侵襲能力，但WFDC2在肺癌細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡中的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究，本研究為肺癌的基因診斷及靶向治療提供了理論基礎(chǔ)。