洪丹丹 任青玲 徐傳花 徐雯雯 王偉 榮慧 郭紅玉 趙玉芹 馬蔚蓉 曹丹丹 陳冰倩

南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科（南京210000）

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)目前宮頸癌發(fā)生率位居世界第一，占每年新增病例29%左右［1］。小檗堿是從黃連、黃柏等中藥中提取的季胺類化合物［2］，可通過調(diào)控p65 等凋亡分子［3］和抑制微管蛋白聚集［4］等途徑抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，但是機(jī)制仍尚未明確。Toll 樣受體（Toll?like receptors，TLRs）可調(diào)控炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，介導(dǎo)機(jī)體天然免疫轉(zhuǎn)向獲得性免疫［5］。TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)TLR相關(guān)蛋白，其下游通路主要通過髓樣分化因子88激活后介導(dǎo)，進(jìn)一步核因子κB（nuclear factor κB，NF?κB）活化［6］。NF?κB是一類具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的Rel 家族轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞增殖與凋亡過程［7］。小檗堿對(duì)于宮頸癌細(xì)胞具有明確的抑制作用，但TLR4?NF?κB是否小檗堿抗癌的具體通路尚未見相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料 Hela 細(xì)胞由江蘇凱基生物提供。小檗堿購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司（純度≥95%，貨號(hào)：B139120）；Trizol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen（貨號(hào)：15596?026）；Lipo 2000（貨號(hào)：12566014）和cDNA 第一鏈合成試劑盒（貨號(hào)：K1622）購(gòu)自美國(guó)TFS；Real time PCR Master Mix 購(gòu)自日本TOYOBO（貨號(hào)：QPR?201）。

1.2 TLR4 siRNA 設(shè)計(jì) 通過Ambion 網(wǎng)站數(shù)據(jù)針對(duì)TLR4 基因設(shè)計(jì)3 條特異性siRNA 序列：TLR4?siRNA?001（上游：CCUGGUGAGUGUGACUAUUTT；下游：AAUAGUCACACUCACCAGGTT）、TLR4?siR?NA?002（上游：CCUGAACCCUAUGAACUUUTT；下游：AAAGUUCAUAGGGUUCAGGTT）、TLR4?siRNA?003（上游：GGACCUCUCUCAGUGUCAATT；下游：UUGACACUGAGAGAGGUCCTT）。隨機(jī)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照siRNA（negative siRNA），上游：UUCUCCGAA?CGUGUCACGUTT；下游：ACGUGACACGUUCGGA?GAATT。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將宮頸癌Hela 細(xì)胞以每孔2×105個(gè)接種于6 孔板，細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%融合度時(shí)，進(jìn)行Lipo 轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為3 組：空白對(duì)照組（control 組）、陰性siRNA 組（negative siRNA組）和TLR4?siRNAs 組（siRNA?001 組，siRNA?002組和siRNA?003 組）。

1.4 qRT?PCR 檢測(cè) siRNA 轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞，Trizol 法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。TLR4 引物的上游為AGCACTTGGACC?TTTCCAGC，下游為TAGGGTTCAGGGACAGGTCT。內(nèi)參GAPDH 引物的上游為TGTTGCCATCAAT?GACCCCTT，下游 為CTCCACGACGTACTCAGCG。反應(yīng)條件為95 ℃5 min，95 ℃15 s，60 ℃20 s，72 ℃40 s，共40 個(gè)循環(huán)。

1.5 Western檢測(cè) siRNA轉(zhuǎn)染8 h后收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA 法定量。取40 μg 蛋白上樣，進(jìn)行10%的SDS?PAGE，濃縮膠80 V、分離膠120 V 恒壓電泳，300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h。加入兔抗人TLR4 或GAPDH抗體過夜，次日羊抗兔IgG孵育，顯色曝光，采集圖像。使用Gel?Pro32 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

1.6 MTT 法描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 收集轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)、配制成濃度為3×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，分別培養(yǎng)0、24、48 和72 h；進(jìn)行MTT 染色，測(cè)定OD值，計(jì)算抑制率描繪生長(zhǎng)曲線。

1.7 Transwell 小室評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移能力檢測(cè) Hela密度1 × 105個(gè)/mL 細(xì)胞懸液100 μL 加入Transwell小室，下室加入500 μL 含20%FBS 的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行固定、染色。直徑上取3 個(gè)視野照相（×200），計(jì)數(shù)。

1.8 熒光TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 自然晾干細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片或爬片），多聚甲醛固定。在樣本上加1%的Triton?100，洗滌、滅活酶、洗滌、蛋白酶K 修復(fù)后進(jìn)行TUNEL 反應(yīng)1 h，DAPI 復(fù)染，熒光顯微鏡觀察。細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）=（凋亡細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)）×100%，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核為棕色，正常細(xì)胞的細(xì)胞核為藍(lán)紫色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表述數(shù)據(jù)，組間比較采用student?t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率分析及目標(biāo)TLR4?siRNA 篩選 轉(zhuǎn)染24 h，隨機(jī)選取10 個(gè)低倍視野，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率達(dá)到（90.55 ± 5.19）%。3 組TLR4?siRNA 均可以有效沉默TLR4 的表達(dá)，分別為57.2%、74.0%和55.6%（P＜0.05），siRNA?002 下調(diào)最為明顯故將siRNA?002 選為目標(biāo)siRNA 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 不同濃度小檗堿對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖水平影響 見圖1，小檗堿（5、10 和40 μg/mL）呈濃度依耐性抑制Hela 細(xì)胞增殖，其中40 μg/mL 最為明顯，24、48 和72 h 的抑制率分別為20.15%、32.21%和39.82%（P＜0.05）。增加陰性siNRA 干預(yù)后，Hela 細(xì)胞增殖抑制率未見明顯改變。增加siRNA?002 干預(yù)后，可明顯增加三種濃度小檗堿對(duì)于Hela 細(xì)胞增殖的抑制作用，其中40 μg/mL 小檗堿+siRNA?002 最為明顯，24、48 和72 h 的抑制率分別為28.04%、65.87%和78.55%（P＜0.05）。

圖1 不同濃度小檗堿對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖水平影響Fig.1 Effects of different concentrations of berberine on the proliferation level of Hela cells in cervical carcinoma

2.3 不同濃度小檗堿對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞遷移水平影響 見圖2，小檗堿（5、10 和40 μg/mL）可呈濃度依耐性抑制Hela 細(xì)胞遷移，遷移細(xì)胞數(shù)分別為141.00 ± 3.61、106.33 ± 3.51 和65.33 ± 3.51（P＜0.05）。增加陰性siNRA 干預(yù)后，Hela 細(xì)胞增殖抑制率未見明顯改變（P＞0.05）。增加siRNA?002 干預(yù)后，可見siRNA?002 可明顯增加3 種濃度小檗堿對(duì)于Hela 細(xì)胞增殖的抑制作用，其中40 μg/mL 小檗堿+siRNA?002 最為明顯（P＜0.05），遷移細(xì)胞數(shù)為43.67±3.79。

圖2 不同濃度小檗堿對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞遷移水平影響Fig.2 Effects of different concentrations of berberine on migration levels of Hela cells in cervical carcinoma

2.4 不同濃度小檗堿對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞凋亡水平影響 見圖3，小檗堿（5、10 和40 μg/mL）可明顯抑制Hela 細(xì)胞凋亡程度，凋亡率分別為（3.8 ±0.3）%、（7.2±0.5）%和（9.1±0.9）%。增加陰性siN?RA 干預(yù)后，Hela 細(xì)胞凋亡率未見明顯改變。加用siRNA?002 后可進(jìn)一步增加Hela 細(xì)胞凋亡程度，凋亡率分別為（6.4 ± 0.8）%、（12.2 ± 1.1）%和（15.2 ±1.2）%。

圖3 TUNEL 評(píng)價(jià)不同濃度小檗堿對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞凋亡水平影響Fig.3 Evaluation of different concentrations of berberine on the apoptosis level of Hela cells in cervical carcinoma by TUNEL

2.5 不同濃度小檗堿對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞p65、Bcl?2 和TLR?4 mRNA 水平表達(dá)影響 見圖4，小檗堿可呈濃度依賴性抑制Hela 細(xì)胞p65、Bcl?2 和TLR4 的mRNA 表達(dá)水平（P＜0.05）。增加陰性siNRA 干預(yù)后，p65、Bcl?2 和TLR4 的mRNA 水平未見明顯改變。而加用siRNA?002 后可進(jìn)一步加強(qiáng)小檗堿對(duì)于Hela 細(xì)胞p65、Bcl?2 和TLR4 mRNA 水平的下調(diào)作用（P＜0.05）。

2.6 不同濃度小檗堿對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞p65、Bcl?2 和TLR4 蛋白水平表達(dá)影響 見圖5，小檗堿均可呈濃度依賴性抑制Hela 細(xì)胞p65、Bcl?2 和TLR?4蛋白表達(dá)（P＜0.05）。增加陰性siNRA 干預(yù)后，p65、Bcl?2 和TLR4 蛋白未見明顯改變。而加用siRNA?002 后可進(jìn)一步加強(qiáng)小檗堿對(duì)于p65、Bcl?2和TLR 蛋白的下調(diào)作用（P＜0.05）。

圖4 不同濃度小檗堿對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞p65、Bcl?2 和TLR4 mRNA 水平表達(dá)影響Fig.4 Effects of different concentrations of berberine on the mRNA levels of p65，bcl?2 and TLR4 mRNA in Hela cells of cervical carcinoma

圖5 不同濃度小檗堿對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞p65、Bcl?2 和TLR?4 蛋白水平表達(dá)影響Fig.5 Effects of different concentrations of berberine on the expression protein levels of p65，bcl?2 and tlr?4 in Hela cells of cervical carcinoma

3 討論

TLRs 作為一種新的模式識(shí)別受體，是天然免疫和獲得性免疫之間的紐帶，也是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通道的起始部位［8］。本研究選擇的TLR4 主要表達(dá)于結(jié)腸癌、乳腺癌和宮頸癌等多種細(xì)胞膜表面，與細(xì)胞增殖程度呈正相關(guān)［9］。本研究結(jié)果提示小檗堿成濃度依耐性抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，減低遷移能力，說明小檗堿具有明顯的抗宮頸癌效果。小檗堿能夠抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，阻滯細(xì)胞周期，增加宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性［10］。小檗堿作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥黃連等的有效成分，亦有許多國(guó)外研究報(bào)道其對(duì)于宮頸癌有效。比如RAGHAV 等［4］通過傅里葉變換紅外光譜發(fā)現(xiàn)小檗堿可改變Hela 細(xì)胞內(nèi)微管蛋白異構(gòu)體構(gòu)象，抑制細(xì)胞內(nèi)骨架的搭建，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究結(jié)果與上述研究相符，均證實(shí)小檗堿對(duì)于Hela細(xì)胞具有抑制作用。

對(duì)于小檗堿抗宮頸癌的相關(guān)具體機(jī)制研究報(bào)道較少，小檗堿可能通過降低金屬基質(zhì)蛋白酶-9和NF?κBp65 水平，對(duì)Hela 細(xì)胞體外增殖具有明顯的抑制作用，能夠減弱Hela 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以明顯抑制Hela 細(xì)胞中TLR4mRNA 和蛋白的表達(dá)水平，并進(jìn)一步下調(diào)p65 和Bcl?2 表達(dá)。p65 是NF?κB 家族的組分之一，靜息狀態(tài)下p65 與IκB 結(jié)合固定，當(dāng)受到核外刺激后，IκB 被磷酸化而降解，從而釋放p65 與κB位點(diǎn)基因特異性結(jié)合，發(fā)揮下游調(diào)節(jié)作用，其中Bcl?2 家族就是下游調(diào)節(jié)靶點(diǎn)之一［12-14］。Bcl?2 家族蛋白可通過與其他凋亡調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用，其主要發(fā)揮抗凋亡作用［15-16］。因此本研究中小檗堿可明顯下調(diào)Bcl?2 表達(dá)，即抑制Hela 細(xì)胞自身的抗凋亡能力。已有研究證實(shí)TLR4?NF?κB為宮頸癌細(xì)胞的重要代謝通路，比如有研究發(fā)現(xiàn)TLR4?siRNA可進(jìn)一步通過調(diào)控NF?κB通路下調(diào)Bcl?2水平，顯著抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［17］。本研究結(jié)果與之相符，并進(jìn)一步證明小檗堿與TLR4?siRNA 作用相同，均可抑制TLR4表達(dá)，發(fā)揮抗宮頸癌作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可調(diào)控TLR4?NF?κB 信號(hào)通路下調(diào)Bcl?2 表達(dá)，顯著抑制Hela 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，為小檗堿治療宮頸癌提供新的理論依據(jù)。