伍恒英 彭蘇珺 布俏雯 張亮 王三鋒 雷雯 李輝斌 馬健 羅喜平

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省婦幼保健院婦科（廣州510010）

宮頸癌是女性第二大常見惡性腫瘤，其發(fā)病率在女性生殖器官惡性腫瘤中排第2 位，其中約90%的宮頸癌死亡發(fā)生在發(fā)展中國家。研究［1］表明，宮頸癌患者中HPV 感染的概率達(dá)到了99%，而且高危型HPV（high risk human papillomavirus，hr?HPV）感染是導(dǎo)致宮頸癌的必要因素，因此針對(duì)HPV 感染的檢測(cè)和治療手段已經(jīng)開展并得到廣泛應(yīng)用。HPV+TCT（液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查）的檢測(cè)方法和HPV 疫苗的使用，使宮頸癌成為可預(yù)防的惡性腫瘤。研究［2-3］表明，無論何種檢測(cè)方法，仍有一小部分宮頸癌患者HPV 的檢測(cè)結(jié)果為陰性，并提出HPV 陰性宮頸癌可能代表生物學(xué)上，與HPV陽性宮頸癌相比預(yù)后較差的腫瘤亞群?，F(xiàn)行依靠HPV 的宮頸癌篩查方法存在較大的漏診風(fēng)險(xiǎn)，因此，尋找能夠區(qū)別于HPV 之外，有效識(shí)別宮頸癌的特異性分子標(biāo)志物，補(bǔ)充目前hr?HPV 陰性宮頸癌易漏診的不足，具有重要意義。研究［4］表明DNA啟動(dòng)子甲基化是惡性腫瘤發(fā)生的早期事件，且與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為宮頸癌早期診斷的特異性分子標(biāo)志。具有序列相似性的19 家族［趨化因子（C?Cmotif）-樣］成員A4（family with sequence similarity 19 member A4，F(xiàn)AM19A4）是TAFA 基因家族成員，國外已有研究［5］發(fā)現(xiàn)FAM19A4 基因啟動(dòng)子甲基化能有效識(shí)別宮頸癌，有望成為新型腫瘤標(biāo)記物。但國內(nèi)外目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道FAM19A4 基因啟動(dòng)子甲基化與hr?HPV陰性宮頸癌相關(guān)性的研究。為探討FAM19A4 基因啟動(dòng)子甲基化在我國婦女hr?HPV 陰性宮頸癌診斷中的價(jià)值，在前期研究基礎(chǔ)上，本文采用雙探針熒光定量PCR 技術(shù)，檢測(cè)hr?HPV 陰性及陽性宮頸癌甲基化檢出率，研究FAM19A4 基因啟動(dòng)子甲基化在hr?HPV 陰性宮頸癌診斷中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年6月至2017年5月在我院治療的宮頸癌患者。本研究的納入標(biāo)準(zhǔn)為：病理切片經(jīng)我院病理科確診或會(huì)診的宮頸癌患者，臨床分期及治療方式均以國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO，2009年）為依據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)為：（1）病理切片未經(jīng)我院病理科會(huì)診；（2）同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩種及兩種上婦科惡性腫瘤；（3）未按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FI?GO，2009年）未標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行治療，無法獲取病理石蠟作為樣本。符合入選條件共490 例。從中篩選出術(shù)前宮頸刷液HPV 檢測(cè)結(jié)果為高危型陰性宮頸癌患者25 例為實(shí)驗(yàn)組，從中隨機(jī)選擇3 例術(shù)前宮頸刷液HPV 檢測(cè)結(jié)果為高危型陽性宮頸癌患者為對(duì)照組。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA 的提取 利用TIANamp FFPE DNA 提取試劑盒（北京天根公司生產(chǎn)）提取石蠟包埋標(biāo)本的DNA，按試劑盒說明書提供的方法操作。以上提取的DNA 使用Quawell Q5000 紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)量，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 HPV?DNA 高通量測(cè)序 由北京邁基諾基因科技股份有限公司完成，基本過程，將提取的DNA，捕獲目的一部分進(jìn)行樣品文庫的制備，進(jìn)一步對(duì)該文庫進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，捕獲目的DNA 片段，使用NextSeq500、HiSeq2500（Rapid）測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序策略為PE150，進(jìn)行最后的信息分析，得到最終的樣本信息。

1.2.3 定量PCR 檢測(cè) 重亞硫酸鹽修飾將剩余的DNA 進(jìn)行重亞硫酸氫鹽處理（模板DNA 濃度為500 ng），利用EZ DNA Methylation?DirectTM試劑盒（美國Zymo Research 公司產(chǎn)品），按試劑盒說明書提供的方法操作。重亞硫酸鹽修飾后的DNA 立即用于熒光定量PCR 檢測(cè)，剩余樣本儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱。

1.2.4 雙探針熒光定量PCR 美國ABI 7500 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（Life Tech）用于進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)樣本中FAM19A4 基因的甲基化情況。以hr?HPV 陽性宮頸癌FFPE?DNA、hr?HPV 陰性宮頸癌FFPE?DNA、雙蒸水分別作為陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照模板。反應(yīng)體系共20 μL，主要包括：2 × Premix Type 試劑10 μL；50 × Rox Reference Dye II 試劑0.2 μL；FAM19A4基因上、下游引物各0.5 μL；ACTB 內(nèi)參基因上、下游引物各0.5 μL；FAM19A4 基因及ACTB 內(nèi)參基因探針各0.8 μL；純水5.2 μL；樣本量1 μL（FAM19A4 基因及ACTB 內(nèi)參基因的引物及探針序列如表1所示）。PC反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性3 min；然后95 ℃變性15 s，56 ℃退火20 s 及65 ℃延伸40 s，共進(jìn)行50 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本均進(jìn)行了3 次重復(fù)試驗(yàn)。擴(kuò)增結(jié)果判定：熒光定量PCR 技術(shù)擴(kuò)增后，經(jīng)ABI 7500 收集熒光信號(hào)，獲得內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的循環(huán)閾值（CT 值）及擴(kuò)增曲線，計(jì)算兩基因CT 值間的閾值差（ΔCT），綜合判定不同樣本的甲基化程度。以ACTB 為內(nèi)參，計(jì)算ΔCT=CT 目標(biāo)基因-CT 內(nèi)參，并同時(shí)結(jié)合擴(kuò)增曲線判斷甲基化情況，且ΔCT 值越小，擴(kuò)增曲線目標(biāo)基因越早擴(kuò)增，表示基因甲基化水平越高。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或連續(xù)校正或Fisher 精確概率法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量檢測(cè)HPV 病毒 25 例宮頸癌樣本經(jīng)過熒光定量PCR、HC?II 兩種方法檢測(cè)HPV 病毒感染情況，12 例（48.0%，12/25）為hr?HPV 陰性，二者檢測(cè)結(jié)果相仿。將12 例樣本作進(jìn)一步高通量測(cè)序，最后結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)組中12 例樣本僅剩余9 例為hr?HPV 陰性，對(duì)照組中3 種檢測(cè)方法型別完全吻合。對(duì)照組3 例樣本經(jīng)3 種檢測(cè)方法檢測(cè)，HPV 結(jié)果吻合。

表1 FAM19A4 及ACTB 基因的引物及探針序列Tab.1 The sequences of primers and probes for the FAM19A4 and ACTB genes

表2 樣本組織學(xué)類型，以及經(jīng)HC?II、熒光定量PCR、高通量靶向測(cè)序檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Sample histology type，as well as HC?II，qPCR，High?throughput sequencing test results

2.2 hr?HPV 陰性與hr?HPV 陽性宮頸癌患者的臨床病理特點(diǎn)比較 表3顯示hr?HPV 陰性及陽性宮頸癌的女性在FIGO 分期、組織病理學(xué)、淋巴轉(zhuǎn)移情況的比較。臨床分期：490 例宮頸癌患者中，早期共162 例，其中hr?HPV 陰性8 例，hr?HPV 陽性348 例；局部晚期共312 例，其中hr?HPV 陰性1 例，hr?HPV 陽性117 例。臨床分期中hr? HPV 陰性與陽性患者的構(gòu)成比分別比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。病理類型：490 例子宮頸癌患者中，鱗癌共387 例，hr?HPV 陰性6 例，hr?HPV 陽性381例；腺癌共38 例，hr?HPV 陰性3 例，hr?HPV 陽性35例。腺癌中hr?HPV 陰性的比例明顯高于hr?HPV陽性患者（P＜0.05）。淋巴轉(zhuǎn)移情況：490 例子宮頸癌患者中，有明確的淋巴轉(zhuǎn)移情況記錄共233例，淋巴轉(zhuǎn)移共40 例，hr?HPV 陰性2 例，hr?HPV陽性38例；淋巴未轉(zhuǎn)移193例，hr?HPV陰性7例，hr?HPV陽性186例。淋巴轉(zhuǎn)移情況中hr?HPV 陰性與陽性患者的構(gòu)成分別比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 hr?HPV 陰性與hr?HPV 陽性宮頸癌患者的臨床病理特點(diǎn)比較Tab.3 Comparison of clinicopathological features of hr?HPV?negative and positive cervical cancer patients 例

2.3 hr?HPV 陰性與hr?HPV 陽性宮頸癌及空白對(duì)照樣本的擴(kuò)增曲線 采用雙探針熒光定量PCR 分別檢測(cè)hr?HPV 陰性與hr?HPV 陽性宮頸癌組織FFPE 中，F(xiàn)AM19A4 基因啟動(dòng)子發(fā)生甲基化的情況，發(fā)現(xiàn)在hr?HPV 陰性與陽性宮頸癌的樣本中甲基化檢出率都是100%。見圖1。

圖1 高危型HPV 陰性、陽性宮頸癌及空白對(duì)照樣本的的擴(kuò)增曲線Fig.1 qMS?PCR amplification curve of high?risk HPV?negative and positive cervical cancer and blank control samples

3 討論

宮頸癌是中國女性最常見的惡性腫瘤之一，1974年德國病毒學(xué)家ZURHAUSEN等［6］提出了HPV 可能在子宮頸癌的發(fā)病過程中起到重要作用的觀點(diǎn)，HPV 與宮頸癌的研究便在國內(nèi)外從未停止，目前普遍認(rèn)知hr?HPV 的持續(xù)性感染是宮頸癌發(fā)病的主要原因，HPV 檢測(cè)已經(jīng)被納入宮頸癌的篩查方案。臨床上關(guān)于hr?HPV 陰性宮頸癌的報(bào)道也不少見，HPV 感染陰性率也是層出不窮，且有報(bào)道［7］hr?HPV 陰性宮頸癌的發(fā)病率不斷升高。RODRíGUEZ?CARUNCHIO 等［8］研究顯示，用HC?II方法初次檢測(cè)子宮頸癌患者的HPV 感染狀況，其陰性率為10.2%，當(dāng)再次用高敏感度的PCR 技術(shù)重復(fù)檢測(cè)時(shí)，其陰性率減少為5.8%。與本研究結(jié)果相似，說明，檢測(cè)方法的不同是導(dǎo)致子宮頸癌患者HPV 感染陰性率報(bào)道大相徑庭的原因之一；也提示，臨床應(yīng)選用敏感的HPV 檢測(cè)方法進(jìn)行子宮頸癌篩查。在本研究中使用高通量測(cè)序的檢測(cè)方法，證明存在宮頸癌存在hr?HPV 陰性的可能，然而采用高通量測(cè)序的方法去進(jìn)行hr?HPV 陰性宮頸癌的診斷，在臨床投入使用的可行性較差，經(jīng)濟(jì)性、效率等方面存在著明顯的不足，那么尋找一種對(duì)HPV 檢測(cè)更加精準(zhǔn)，又或者能獨(dú)立于HPV 病毒之外的宮頸癌的篩查方法顯得尤為重要。

高危型HPV 感染是宮頸癌及其癌前病變的主要致病原因，hr?HPV 還能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生遺傳及表觀遺傳學(xué)的改變導(dǎo)致癌變［9］。那么通過表觀遺傳學(xué)進(jìn)行腫瘤早期診斷是否能成為一條新的檢測(cè)路徑？DNA甲基化是最常見的表觀遺傳學(xué)之一，通過檢測(cè)表觀遺傳學(xué)的變異，診斷腫瘤具有更高的穩(wěn)定性、靈敏度和特異度。STEENBERGEN 等［9］首先使用人染色體核型分析技術(shù)在宮頸組織水平驗(yàn)證了FAM19A4 基因啟動(dòng)子甲基化有望作為宮頸癌的新型靶向分子標(biāo)記物。研究［10］發(fā)現(xiàn)，正常宮頸相比，F(xiàn)AM19A4 基因甲基化檢出率在宮頸癌中異常增高，能有效的檢測(cè)宮頸癌。FAM19A4 基因甲基化可能促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，是宮頸細(xì)胞癌變的特異性生物標(biāo)志物。在本研究中，對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組的hr?HPV 陽性宮頸癌及陰性宮頸癌甲基化檢出率沒有差異。因此推測(cè)，甲基化診斷宮頸癌的的檢測(cè)方法能夠不受HPV 的干擾，尤其是在hr?HPV 陰性宮頸癌的診斷優(yōu)勢(shì)更加突出。因此甲基化的檢測(cè)方法在宮頸癌篩查中的意義不容忽視。

本研究與先前報(bào)道的結(jié)果一致，hr?HPV 陰性更常見于腺癌［11-12］。這可能與宮頸腺癌的亞型較多，HPV 檢測(cè)無法完全覆蓋有關(guān)，甚至有學(xué)者［13］提出宮頸腺癌致病原因是HPV 以外的病原體引起。hr?HPV 陰性宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)在臨床分期中本研究中hr?HPV 陰性宮頸癌患者的臨床分期更偏早期，這與FISCHEROVá等［14］研究結(jié)果相反。推測(cè)是因?yàn)閷m頸癌的不斷進(jìn)展，HPV 病毒脫失，進(jìn)而造成晚期宮頸癌hr?HPV 檢測(cè)結(jié)果呈陰性。研究［15］發(fā)現(xiàn)FAM19A4 基因甲基化可能與病理類型、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無關(guān)。因此，hr?HPV 陰性宮頸癌是一種臨床病理較為特殊的宮頸癌，將甲基化檢測(cè)用于它的診斷，能夠減少臨床病理不同帶來的影響，減少漏診風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究從宿主基因水平的變化表明了宮頸組織可能受表觀遺傳影響發(fā)生癌變，突破傳統(tǒng)的宮頸癌伴隨著高危型HPV 感染的觀念。本研究的主要優(yōu)勢(shì)在于使用熒光定量PCR、HC?II、高通量測(cè)序多種HPV 檢測(cè)方法重復(fù)檢測(cè)樣本HPV感染情況，且以高通量測(cè)序?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行分析，探討FAM19A4 基因甲基化在hr?HPV 陰性宮頸癌診斷中的作用。本研究的主要局限是樣本量較少，需要更大的樣本量，減少實(shí)驗(yàn)中可能存在的偏倚；而且FEEP 樣本提取DNA 過程中，有可能出現(xiàn)HPV 病毒脫失或者病毒已被免疫機(jī)制清除等可能，導(dǎo)致取材受到影響。未來研究中將繼續(xù)收集高危型HPV 陰性宮頸癌組織及宮頸細(xì)胞刷液樣本進(jìn)行分析，減少統(tǒng)計(jì)結(jié)果中的偏倚，希望將該基因甲基化檢測(cè)應(yīng)用在高危型HPV 陰性宮頸癌的早期診斷中。