鄧展瑞, 贠建民, 郭 娟, 牛耀星, 李彥虎

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 蘭州 730070

臘肉是一種中國特色傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品，具有色澤鮮美、風(fēng)味濃厚、食用方便、便于貯藏等特點(diǎn)[1]。傳統(tǒng)的臘肉制品是以新鮮的畜禽肉為原料，添加一定的輔料，經(jīng)過腌制、風(fēng)干等多道工序加工而成[2]，我國臘肉按地區(qū)可分為四川臘肉、甘肅隴西臘肉、湖南臘肉、廣東臘肉等[3]。隴西臘肉是以五花肉為原料，添加食鹽、八角、花椒等十多種輔料，以傳統(tǒng)的生產(chǎn)加工方式腌制而成[4]。

長期以來，臘肉制品多通過手工作坊生產(chǎn)，多種微生物自然發(fā)酵產(chǎn)生的獨(dú)特風(fēng)味物質(zhì)賦予了其良好的口感[5]。但由于在臘肉生產(chǎn)加工過程中缺乏對(duì)微生物的有效控制，臘肉在貨架期易發(fā)生微生物性腐敗等不同程度的質(zhì)量問題[6]，而且傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品工業(yè)化生產(chǎn)及工藝現(xiàn)代化改造等方面的研究起步較晚，這種狀況制約了傳統(tǒng)肉制品加工產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。

本研究以隴西臘肉為分離材料，通過經(jīng)典形態(tài)學(xué)分類和生理生化鑒定，分析隴西臘肉中的優(yōu)勢乳酸菌；并通過測定優(yōu)勢乳酸菌菌株的產(chǎn)酸能力、生長特性、耐氯化鈉和亞硝酸鈉能力以及產(chǎn)氣、產(chǎn)黏液、產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的能力等，篩選出具有優(yōu)良發(fā)酵性能的菌株；隨后開展人工接種優(yōu)良菌株的臘肉模擬加工試驗(yàn)，分析其對(duì)臘肉感官品質(zhì)的影響，以期篩選出可用于隴西臘肉加工的發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌，為隴西臘肉發(fā)酵劑的研制及其向工藝現(xiàn)代化改造發(fā)展提供一定的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用隴西臘肉為甘肅省隴西縣大胡子臘肉。采樣階段：原料肉、腌制中期(1～25 d，于第23 d采樣)、腌制后期(26～45 d，于第45 d采樣)、風(fēng)干中期(46～90 d，于第70 d采樣)、成品肉。每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)3次重復(fù)。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；XSP-SM02型顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)；pHS-3C型pH計(jì)(上海雷諾儀器廠)；FA1204B型電子天平和722S型可見分光光度計(jì)均購自上海佑科儀器儀表有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱和電熱恒溫培養(yǎng)箱均購自上海精宏儀器設(shè)備有限公司。

1.3 微生物計(jì)數(shù)

1.3.1取樣 ①表面取樣。隴西臘肉的表面取樣參照GB 4789.17-2003[14]，采用棉拭取樣法。首先，制作1個(gè)5 cm2(2.5 cm×2 cm)的取樣器，于無菌條件下，在隴西臘肉的表面確定10個(gè)點(diǎn)。然后，將5 cm2的取樣器依次壓在隴西臘肉表面已確定的10個(gè)點(diǎn)上，將滅菌棉簽稍沾濕，于取樣器5 cm2的范圍內(nèi)揩抹多次，隨后立即剪斷，投入裝有50 mL滅菌水的錐形瓶中。10個(gè)棉簽完全浸在錐形瓶的無菌水中，將錐形瓶放置在搖床培養(yǎng)箱中，于30℃、160 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)30 min，然后取瓶中的液體作為基礎(chǔ)液，再按要求作10倍遞增稀釋。

②內(nèi)部取樣。隴西臘肉的內(nèi)部面取樣參照GB 4789.17-2003[14]。將內(nèi)部面進(jìn)行表面灼燒消毒，再用無菌剪刀剪取隴西臘肉內(nèi)部深層肌肉25 g，放入滅菌乳缽內(nèi)，用滅菌剪刀剪碎后，加入滅菌海沙，磨碎后加入滅菌水225 mL，混勻，即為10-1稀釋液。

1.3.2乳酸菌計(jì)數(shù) 乳酸菌計(jì)數(shù)方法參照GB 4789.2-2016[15]。乳酸菌計(jì)數(shù)通常選用菌落個(gè)數(shù)在30～300之間的平板進(jìn)行。

1.4 優(yōu)勢乳酸菌的鑒定

1.4.1優(yōu)勢乳酸菌的菌落觀察 選取適宜濃度的隴西臘肉不同加工階段的微生物稀釋液涂布在MRS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后，對(duì)平板上菌落形態(tài)不同且數(shù)量多的單菌落進(jìn)行純化；再以革蘭氏染色為陽性、在含有2% CaCO3的MRS培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)溶鈣圈為標(biāo)準(zhǔn)，篩選符合條件的菌株，并進(jìn)行單菌落形態(tài)觀察和菌落特征描述。

1.4.2優(yōu)勢乳酸菌的細(xì)胞形態(tài)觀察 根據(jù)《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》[16]的方法，挑取MRS固體培養(yǎng)基上的優(yōu)勢乳酸菌株菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡(目鏡10×，物鏡100×)下觀察菌株的細(xì)胞形態(tài)。

1.4.3優(yōu)勢乳酸菌的生理生化鑒定 以《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[17]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]為參考依據(jù)，將初篩得到的菌株通過石蕊牛奶分解、V-P產(chǎn)生、接觸酶檢測、革蘭氏染色、七葉靈水解、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原、氧化酶檢測、明膠水解、運(yùn)動(dòng)性檢測、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

1.5 發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株篩選

1.5.124 h產(chǎn)酸能力測定 通過活化篩選出的優(yōu)勢乳酸菌菌株得到種子液，將種子液按照1%比例接種在150 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24 h，每4 h吸取5 mL發(fā)酵液，用pH計(jì)測定相應(yīng)的pH。

1.5.2生長曲線的測定 參照潘曉倩等[19]的方法。通過活化篩選出的優(yōu)勢乳酸菌菌株得到種子液，將種子液按照1%比例接種在150 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24 h，每2 h吸取10 mL發(fā)酵液，以未接種的MRS培養(yǎng)基做空白對(duì)照，測量每株菌株發(fā)酵液的OD600，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD600為縱坐標(biāo)繪制其生長曲線。

1.5.3耐受能力測定 參照胡美忠等[20]的方法測定菌株對(duì)6.5%氯化鈉和150 mg/L亞硝酸鈉的耐受能力。通過活化篩選出的優(yōu)勢乳酸菌菌株得到種子液，將種子液按照1%比例分別接種在添加了6.5% NaCl和150 mg/L NaNO2的100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃靜置培養(yǎng)24 h后，以空白MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，分別測定各菌株菌液的OD600。

1.5.4產(chǎn)黏液能力測試 參照胡美忠等[20]的方法。將篩選得到的優(yōu)勢乳酸菌菌株接種于MRS固體培養(yǎng)基(其中以蔗糖代替葡萄糖)上，30℃培養(yǎng)24 h，用接種針挑取菌落直接觀察是否出現(xiàn)黏液。

1.5.5產(chǎn)氣能力測試 參照胡美忠等[20]的方法。將篩選得到的優(yōu)勢乳酸菌菌株穿刺接種到含0.8%瓊脂的MRS培養(yǎng)基試管中，再向試管中傾倒2 cm 2%瓊脂封口，37℃培養(yǎng)48 h，觀察試管產(chǎn)生氣泡情況，若試管內(nèi)出現(xiàn)氣泡或者頂起2%的瓊脂，說明產(chǎn)氣。

1.5.6產(chǎn)酶能力測定 利用瓊脂板法測定菌株產(chǎn)蛋白酶能力[21]。將篩選得到的乳酸菌接種在添加了10%脫脂牛奶的MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)72 h后觀察菌落周圍是否出現(xiàn)蛋白水解圈。參照胡珺等[22]的方法測定菌株產(chǎn)脂肪酶能力。將篩選得到的優(yōu)勢乳酸菌菌株劃線培養(yǎng)于MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)48 h后進(jìn)行活化，將活化后的菌落轉(zhuǎn)接種于添加了1%三丁酸甘油酯的MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)72 h后觀察菌落周圍是否出現(xiàn)脂肪水解圈。

1.6 乳酸菌優(yōu)良菌株的分子生物學(xué)鑒定

提取篩選出的優(yōu)良菌株的總DNA，16S rDNA擴(kuò)增和測序由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成，將測序所得的16S rDNA序列校對(duì)后，利用NCBI的GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析，根據(jù)序列同源性，確定菌株的種屬關(guān)系。采用MEGA 7.0建立菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 接種乳酸菌優(yōu)良菌株的模擬臘肉發(fā)酵試驗(yàn)

將新鮮菌液按2%的接種量轉(zhuǎn)接至MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24 h，于4℃ 5 000 r/min離心15 min后收集沉淀，用無菌生理鹽水洗滌，再次離心收集沉淀，隨后加入無菌生理鹽水將菌體懸浮，制備107CFU/g菌懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在甘肅省隴西縣大胡子臘肉生產(chǎn)基地，在傳統(tǒng)的隴西臘肉制作工藝方法和配料的基礎(chǔ)上，對(duì)原料肉進(jìn)行乳酸菌優(yōu)良菌株的噴涂接種，接種量為1 mL/kg。原料肉大小為40 cm×15 cm，約4 kg。55 d后獲得成品肉。同時(shí)，以未進(jìn)行接種的臘肉作為對(duì)照組。

1.8 成品肉感官評(píng)價(jià)

選擇15位專業(yè)人員組成感官評(píng)定小組，將接種和未接種的臘肉分別在高壓鍋內(nèi)蒸30 min，蒸熟后切成厚度為4～5 mm的切片，分別對(duì)2種產(chǎn)品的氣味、滋味、色澤、口感和組織結(jié)構(gòu)5項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定(表1)，確定產(chǎn)品整體可接受性。根據(jù)臘肉產(chǎn)品的感官要求，設(shè)定各指標(biāo)的權(quán)重為氣味0.3、滋味0.3、色澤0.2、口感0.1、組織結(jié)構(gòu)0.1。

表1 感官評(píng)價(jià)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standard of sensory evaluation.

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)所得，然后利用SPSS 20進(jìn)行顯著性分析、Excel 2010計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差、Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 隴西臘肉加工過程中乳酸菌數(shù)量動(dòng)態(tài)變化

為了更好地控制隴西臘肉加工過程中的有益菌群，保證產(chǎn)品品質(zhì)，首先對(duì)隴西臘肉加工過程中乳酸菌數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了分析。圖1反映了隴西臘肉加工過程不同階段表面和內(nèi)部乳酸菌數(shù)的變化規(guī)律。從原料肉到成品肉，隴西臘肉表面和內(nèi)部的乳酸菌數(shù)均呈先升高后降低趨勢。每個(gè)階段中表面乳酸菌數(shù)都比內(nèi)部乳酸菌數(shù)多，但腌制中后期表面乳酸菌數(shù)比內(nèi)部乳酸菌數(shù)增長速度慢，從腌制中期到腌制后期，表面和內(nèi)部的乳酸菌數(shù)分別增長了7.22倍和38.11倍；到風(fēng)干中期，隴西臘肉表面和內(nèi)部的乳酸菌數(shù)達(dá)到峰值，分別為3.62×107CFU/g和2.77×106CFU/g，表面乳酸菌數(shù)比內(nèi)部乳酸菌數(shù)高出3.34×107CFU/g；之后隨著加工過程的進(jìn)行，乳酸菌數(shù)逐漸下降。

從原料肉到腌制后期，由于肉塊基質(zhì)中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，且pH、水分活度適宜，有利于乳酸菌的生長，因而引起表面和內(nèi)部的乳酸菌數(shù)持續(xù)增加；到了風(fēng)干中期，因?yàn)槿鈮K要懸于晾曬架上進(jìn)行晾曬，肉塊開始與空氣接觸，來自環(huán)境的乳酸菌又附著在肉塊表面并開始生長繁殖，且這個(gè)階段肉塊基質(zhì)中水分含量和營養(yǎng)物質(zhì)也滿足乳酸菌生長需要，因此，表面和內(nèi)部的乳酸菌數(shù)仍在逐漸增加。但是隨著風(fēng)干的進(jìn)行，肉塊基質(zhì)中的水分含量迅速下降，同時(shí)因微生物的生長消耗，基質(zhì)中還原糖含量逐漸減少，不適宜乳酸菌生長，從而使隴西臘肉表面和內(nèi)部的乳酸菌數(shù)呈下降趨勢。

從乳酸菌數(shù)在肉塊基質(zhì)的分布來看，內(nèi)部乳酸菌數(shù)量明顯低于表面，這可能是由于內(nèi)部乳酸菌主要是從表面侵入肉塊的。而在腌制中后期，表面乳酸菌數(shù)量比內(nèi)部乳酸菌增長速度緩慢，這是由于在腌制過程中，大量食鹽和辛香料的添加，致使肉塊表面滲透壓迅速增加，并隨食鹽和辛香料從肉塊表面慢慢滲入內(nèi)部。由于表面食鹽濃度高于內(nèi)部，所以肉塊基質(zhì)表面的水分活度低于內(nèi)部的水分活度，不利于乳酸菌等微生物的生長，從而導(dǎo)致內(nèi)部乳酸菌增長速度比表面的快。

圖1 隴西臘肉加工過程乳酸菌數(shù)的變化趨勢Fig.1 Changing trend of LAB number during the processing of Longxi bacon.

2.2 優(yōu)勢乳酸菌分離鑒定

選取適宜濃度的隴西臘肉不同加工階段的微生物稀釋液涂布在MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，隨后在平板上挑取菌落形態(tài)不同且數(shù)量多的單菌落，利用平板劃線法，將分離到的菌株在MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，共得到38株乳酸菌。經(jīng)革蘭氏染色試驗(yàn)以及在含有2% CaCO3的MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)一步篩選獲得7株符合條件的菌株，即革蘭氏染色為陽性、有溶鈣圈且溶鈣圈與菌落直徑之比大的菌株[23]。將初篩得到的7株菌株分別編號(hào)為R-1、R-2、R-3、R-4、R-5、R-6和R-7(圖2)。其中，腌制中期分離出的菌株為R-2和R-6；腌制后期分離出的菌株為R-3；風(fēng)干中期分離出的菌株為R-1、R-4和R-7；成品肉分離出的菌株為R-5。

以《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[17]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]為參考依據(jù)，對(duì)篩選出的7株優(yōu)勢菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類和生理生化鑒定。由表2和表3可知，R-1為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，R-2為米酒乳桿菌(L.sake)，R-3為乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，R-4為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，R-5為腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，R-6為食品乳桿菌(L.alimentarius)和R-7為彎曲乳桿菌(L.curvatus)。

圖2 乳酸菌菌株的溶鈣圈大小Fig.2 Sizes of dissolved calcium circle of LAB strains.

表2 乳酸菌菌株的形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of LAB.

2.3 發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌篩選

2.3.124 h產(chǎn)酸能力測定 乳酸菌的24 h產(chǎn)酸能力是衡量菌株品質(zhì)優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)[24]。圖3揭示了乳酸菌在發(fā)酵過程中pH的變化規(guī)律。隨著時(shí)間的延長，培養(yǎng)基的pH不斷降低，所有菌株培養(yǎng)基pH由最初的6.78左右下降到了4.27以下。其中R-1和R-4下降幅度最大，在培養(yǎng)24 h后pH分別為3.30和3.47。菌株在生長過程中的前12 h，pH迅速下降，主要與培養(yǎng)初期乳酸的形成有關(guān)，12 h后，菌株產(chǎn)酸能力減弱，pH的下降速度開始減慢。

2.3.2生長曲線測定 在臘肉制品加工過程中，乳酸菌的生長情況也起著非常重要的作用。乳酸菌可通過產(chǎn)生酸性物質(zhì)抑制某些不耐酸的有害菌生長，從而抑制腐敗菌和致病菌對(duì)臘肉制品的危害[25,26]。將7株菌株的種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，菌株的生長曲線如圖4所示，0～2 h為菌株的延遲期，時(shí)間較短；2 h到10～12 h為對(duì)數(shù)期；10～12 h到24 h為穩(wěn)定期?？梢?株菌株的延遲期較短，穩(wěn)定期時(shí)間較長。其中R-1和R-4對(duì)數(shù)期增長速度最快，R-1的OD600由0.143增長到2.027，R-4的OD600由0.111增長到1.705。7株菌株的生長速度由快到慢分別是R-1>R-4>R-2>R-6>R-7>R-5>R-3，其中R-1生長速度最快。

表3 乳酸菌菌株的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of LAB.

圖3 乳酸菌的產(chǎn)酸能力Fig.3 Acid-producing capacity of LAB.

2.3.3耐受能力測定 對(duì)NaCl的耐受能力是選擇發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑的一個(gè)重要因素，實(shí)際生產(chǎn)要求菌株至少耐受6% NaCl[27]。從圖5可以看出，添加6% NaCl后7株菌株的生長均受到了不同程度的抑制。其中R-1受抑制程度最小(P<0.05)，添加NaCl后OD600由1.989下降至1.887，抑制程度為5.09%；R-2受抑制程度最大(P<0.01)，添加NaCl后OD600由1.342下降至0.737，抑制程度為45.10%；R-3、R-4、R-5、R-6、R-7受抑制程度分別為17.33%、14.11%、22.57%、16.39%、18.34%。

圖4 乳酸菌的生長曲線Fig.4 Growth curve of LAB.

GB 2762-2017規(guī)定亞硝酸鈉在肉制品中的最大使用量是150 mg/kg[28]，GB 2760-2014規(guī)定亞硝酸鈉在肉制品中的最大殘留量不超過30 mg/kg[29]。如圖5所示，當(dāng)NaNO2濃度為150 mg/kg時(shí)，7株菌株生長均受到不同程度抑制，其中R-1受抑制程度最小(P<0.05)，添加NaNO2后OD600由1.989下降至1.763，抑制程度為11.37%；R-5受抑制程度最大(P<0.01)，添加NaNO2后OD600由1.103下降至0.750，抑制程度為30.12%；R-2、R-3、R-4、R-6、R-7的抑制程度分別為23.33%、15.50%、23.97%、25.33%、14.94%。

圖5 乳酸菌耐氯化鈉和亞硝酸鈉的能力Fig.5 Tolerance to sodium choride and sodium nitrite of LAB.

2.3.4產(chǎn)氣、產(chǎn)黏液及產(chǎn)酶能力測定 在臘肉加工過程中，一些乳酸菌經(jīng)異型乳酸發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生醋酸和CO2，影響產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)、組織結(jié)構(gòu)[30]；而乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的黏液會(huì)影響肉制品的顏色、質(zhì)地甚至口味[31]。同時(shí)，肉制品在發(fā)酵過程中，在其內(nèi)源蛋白酶的作用下，將蛋白質(zhì)降解為氨基酸或多肽等，對(duì)于發(fā)酵肉制品良好風(fēng)味的形成至關(guān)重要。因此，肉制品發(fā)酵所使用的微生物發(fā)酵劑不應(yīng)具有較強(qiáng)的分解蛋白質(zhì)的能力[32]。另外，微生物發(fā)酵劑也不應(yīng)具有降解脂肪的能力，否則會(huì)將脂肪降解為游離脂肪酸，進(jìn)而形成碳基化合物等小分子物質(zhì)，導(dǎo)致發(fā)酵肉制品酸敗[33]。

7株菌株的基本發(fā)酵特性結(jié)果如表4所示?？芍?，只有R-5產(chǎn)黏液；只有R-5和R-6發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣，其他菌株均不產(chǎn)氣；所有菌株均對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪無分解作用。

表4 優(yōu)勢乳酸菌發(fā)酵性能Table 4 The fermentation performance of LAB.

注：+為陽性反應(yīng)；-為陰性反應(yīng)。

綜上所述，結(jié)合菌株的產(chǎn)酸能力、生長能力和耐受能力，在所有菌株中，R-1產(chǎn)酸能力強(qiáng)、生長速度更快，對(duì)食鹽和亞硝酸鈉均具有較好的耐受性。所以在7株菌株中，R-1更適合作為隴西臘肉加工過程中的乳酸菌發(fā)酵劑。

2.4 乳酸菌R-1的分子生物學(xué)鑒定

菌株R-1的PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析結(jié)果如圖6所示，得到1條約1 500 bp的DNA片段，符合細(xì)菌16S rRNA序列長度，測序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，菌株R-1的16S rRNA序列與GenBank中LactobacillusplantarumLP2(登錄號(hào)為CP020816.1)的序列同源性達(dá)到98%。因此，菌株R-1的16S rRNA分子生物學(xué)鑒定結(jié)果為植物乳桿菌(L.plantarum)，這與R-1生理生化鑒定結(jié)果一致。

圖6 菌株R-1的16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 PCR-amplified results of 16S rRNA gene from R-1.

2.5 人工接種乳酸菌R-1的模擬臘肉發(fā)酵試驗(yàn)

在傳統(tǒng)的隴西臘肉制作工藝的基礎(chǔ)上，對(duì)原料肉進(jìn)行乳酸菌R-1的人工噴涂，獲得成品肉后，由專業(yè)人員進(jìn)行感官評(píng)定。由圖8可知，接種菌株R-1后，與對(duì)照組相比，接種菌株的成品臘肉除口感和色澤外，其他感官品質(zhì)指標(biāo)如氣味、滋味、組織結(jié)構(gòu)和整體可接受性均顯著高于未接種菌株的臘肉(P<0.05)。接種菌株的臘肉在保持了隴西臘肉原有的風(fēng)味、酸味純正等優(yōu)良品質(zhì)的基礎(chǔ)上，有效降低了因脂肪降解為游離脂肪酸而造成的產(chǎn)品酸敗的發(fā)生，同時(shí)改善了傳統(tǒng)臘肉制作工藝下某些乳酸菌通過異型乳酸發(fā)酵產(chǎn)氣造成的臘肉結(jié)構(gòu)松散的問題，證明接種菌株R-1可使隴西臘肉的品質(zhì)得到提升。

圖7 菌株R-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of strain R-1.

圖8 隴西臘肉模擬臘肉發(fā)酵試驗(yàn)感官評(píng)價(jià)結(jié)果Fig.8 Sensory evaluation results of the simulated Longxi bacon fermentation test.

3 討論

乳酸菌是傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中重要的優(yōu)勢菌群，在自然發(fā)酵過程中占重要地位，與產(chǎn)品的品質(zhì)有著密切的關(guān)聯(lián)。如白琴琴等[34]從3種不同發(fā)酵肉制品中篩選出的優(yōu)勢乳酸菌為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)。而從臘魚和臘腸中篩選出的具有潛在應(yīng)用價(jià)值的乳酸菌分別為米酒乳桿菌(L.sake)、植物乳桿菌(L.plantarum)、干酪乳桿菌(L.casei)及鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)[35]。本研究從隴西臘肉中分離出了7株優(yōu)勢乳酸菌菌株，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性分別鑒定為植物乳桿菌(L.plantarum)、米酒乳桿菌(L.sake)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、食品乳桿菌(L.alimentarius)和彎曲乳桿菌(L.curvatus)。

肉制品的發(fā)酵一般采用2種方式：一種是自然發(fā)酵，另一種是人工輔助接種發(fā)酵。目前，隴西臘肉采用在自然條件下發(fā)酵，這種粗放式的生產(chǎn)工藝使得隴西臘肉存在生產(chǎn)周期過長、品質(zhì)不可控等問題。篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌作為隴西臘肉的輔助發(fā)酵劑菌株，可為產(chǎn)品風(fēng)味的改善和臘肉安全性的提高奠定基礎(chǔ)。因此，從隴西臘肉中分離出的7株優(yōu)勢乳酸菌菌株經(jīng)一系列發(fā)酵性能測試，篩選得到1株發(fā)酵性能優(yōu)良，經(jīng)鑒定為植物乳桿菌(L.plantarum)。該菌株生長性能良好，產(chǎn)酸能力強(qiáng)，在6% NaCl和150 mg/kg NaNO2環(huán)境下均具有較好的耐受性，不產(chǎn)氣、不產(chǎn)黏液，對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪均無分解作用，這些特性均有利于改善發(fā)酵肉制品的品質(zhì)。這與劉有晴等[36]對(duì)四川臘肉中乳酸菌的篩選、產(chǎn)酸特性分析結(jié)果一致。而且，在隴西臘肉加工過程中接種植物乳桿菌(L.plantarum)R-1的試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了其能夠改善產(chǎn)品風(fēng)味，使成品表現(xiàn)出更好的感官可接受性。因此，菌株R-1具有可開發(fā)為隴西臘肉輔助發(fā)酵菌劑的潛質(zhì)，可為隴西臘肉乃至傳統(tǒng)腌臘肉制品發(fā)酵劑的研制提供一定的理論依據(jù)。但關(guān)于該菌株在其他傳統(tǒng)腌臘肉制品中的應(yīng)用及與其他菌種結(jié)合開發(fā)復(fù)配發(fā)酵劑，還有待于進(jìn)一步研究。