陳 媛, 李金陽(yáng), 張宇宏, 劉 波, 張志偉, 徐欣欣*, 張 偉

1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 山西 太谷 030801；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)是一種無(wú)毒無(wú)害的絲狀真菌，與其他絲狀菌相比，它具有生長(zhǎng)速度快、最適生長(zhǎng)溫度高(45℃)、培養(yǎng)時(shí)不易受其他雜菌污染等優(yōu)點(diǎn)[1]。另外，特異腐質(zhì)霉具有完善的纖維素酶和半纖維素酶系表達(dá)分泌能力，其中包括至少2種纖維二糖水解酶、7種內(nèi)切葡聚糖酶、5種β-葡萄糖苷酶、5種木聚糖酶和3種木糖苷酶等[2～9]。

目前，特異腐質(zhì)霉來(lái)源的多種纖維素分解酶已成功實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)和性質(zhì)鑒定[2～4,10,11]。與木霉、曲霉和青霉屬來(lái)源的酶不同，特異腐質(zhì)霉的纖維素分解酶具有最適pH偏中性、良好的耐堿性和耐熱性等特點(diǎn)[2,4]。這些優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)使它們?cè)诩徔?、洗滌和釀酒工業(yè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[12～14]，其中多種纖維素酶已實(shí)現(xiàn)商品化，如內(nèi)切葡聚糖酶EGV(Carezyme, Novozymes)是重要的洗滌用酶，β-葡聚糖酶制劑(Ultraflo L, Novozymes)在啤酒釀造過(guò)程中可以改善麥芽釀造性能和提高麥汁的過(guò)濾速度。

盡管對(duì)于特異腐質(zhì)霉的分子生物學(xué)研究與應(yīng)用已經(jīng)展開(kāi)，但由于原始菌株纖維素酶的表達(dá)水平過(guò)低，從而無(wú)法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。已有研究通過(guò)對(duì)特異腐質(zhì)霉進(jìn)行多重理化因子誘變，獲得的纖維素酶高產(chǎn)菌株的濾紙酶活力、CMC-Na(羧甲基纖維素鈉)酶活力和β-葡萄糖苷酶活力分別提高了60.15%、3.19%和59.78%[15]。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所錢(qián)世均研究員利用紫外誘變及離子束誘變的方法對(duì)特異腐質(zhì)霉菌株進(jìn)行誘變以提高纖維素酶產(chǎn)量，篩選得到突變菌株的內(nèi)切β-1,4葡聚糖酶活力、濾紙酶活力較原始菌株分別提高了78.57%和106.81%[16]。然而，迄今為止，關(guān)于特異腐質(zhì)霉中纖維素酶高產(chǎn)機(jī)制的研究尚鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期工作中，為了篩選特異腐質(zhì)霉的纖維素酶高產(chǎn)菌株，成功建立了根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的特異腐質(zhì)霉高效轉(zhuǎn)化體系，并使用T-DNA插入突變技術(shù)構(gòu)建了隨機(jī)突變體文庫(kù)[17,18]。在此基礎(chǔ)上，本研究篩選鑒定得到纖維素分解能力顯著增強(qiáng)的突變體T53，并對(duì)其中的T-DNA插入位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定分析。有助于豐富對(duì)特異腐質(zhì)霉中纖維素酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并對(duì)基因工程手段構(gòu)建纖維素酶高產(chǎn)菌株具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌株、試劑 特異腐質(zhì)霉H.insolensY1分離于河北省張家口市森林土壤，保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保存號(hào)為CGMCC 4573[2]。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliTrans1-T1和BL21 (DE3)及克隆載體pEASY-T3和pEASY-Blunt克隆載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。TaqDNA聚合酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自Promega公司；微晶纖維素、CMC-Na、木聚糖、對(duì)硝基苯-葡萄糖苷(pNPG)和對(duì)硝基苯-纖維二糖苷(pNPC)購(gòu)自Sigma公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2培養(yǎng)基 CMC-Na培養(yǎng)基：10 g/L羧甲基纖維素鈉，1 g/L蛋白胨，20 g/L酵母提取物，0.6 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L脫氧膽酸鈉，15 g/L瓊脂粉，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g/L微晶纖維素，20 g/L酵母提取物，1 g/L蛋白胨，0.6 g/L MgSO4·7H2O，pH 6.8。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1隨機(jī)突變體的篩選 以PDA平板培養(yǎng)并收集不同突變菌株與野生型菌株H.insolensY1孢子，分別取約108個(gè)孢子接于CMC-Na培養(yǎng)基，42℃生長(zhǎng)3天，然后于培養(yǎng)皿中加入剛果紅染色30 min，并用NaCl溶液洗滌30 min[18]。觀察不同突變菌株產(chǎn)生的透明圈大小，篩選比野生型透明圈大的突變株。

1.2.2搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)及纖維素酶活的測(cè)定 PDA平板培養(yǎng)并收集突變株T53與野生型特異腐質(zhì)霉菌株孢子，取約107個(gè)孢子分別接入盛有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，42℃ 220 r/min培養(yǎng)6 d。每天收集樣品，并離心取上清進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)物的纖維素酶活測(cè)定。濾紙酶活力(FPase)、內(nèi)切β-1,4葡聚糖酶活力(CMCase)以及木聚糖酶(xylanase)活力測(cè)定使用3，5-二硝基水楊酸(DNS)方法[17];葡萄糖苷酶(pNPGase)活力、纖維二糖水解酶(pNPCase)活力使用以對(duì)硝基苯(pNP)為底物的方法進(jìn)行測(cè)定[18]。濾紙酶活力計(jì)算公式：

FPase(U/mL)=(411.60×OD540+109.31)/180.16×(1/30)×(1/0.04)×稀釋倍數(shù)

內(nèi)切β-1,4葡聚糖酶活以及木聚糖酶活計(jì)算公式：

CMCase/xylanase (U/mL)=(411.60×OD540+109.31)/180.16×(1/10)×(1/0.1) ×稀釋倍數(shù)

葡萄糖苷酶酶活、纖維二糖水解酶酶活計(jì)算公式：

pNPGase/pNPCase(U/mL)=(0.1149×OD405+0.0024)/10×(1/0.25)×稀釋倍數(shù)

1.2.3蛋白電泳檢測(cè) 取突變株T53與野生型菌株第3天至第6天發(fā)酵上清進(jìn)行蛋白電泳。12%(w/V)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)[19]?？捡R斯亮藍(lán)G-250染色蛋白質(zhì)。

1.2.4突變位點(diǎn)的鑒定 提取突變菌株T53的基因組DNA，參照Liu等[20]的方法進(jìn)行TAIL-PCR，擴(kuò)增T53菌株中T-DNA的側(cè)翼片段。膠回收目的片段并連入克隆載體pEASY-Blunt，進(jìn)行測(cè)序和BlastX比對(duì)分析。將克隆得到的側(cè)翼序列與特異腐質(zhì)霉基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，從而確定突變子T53插入突變的靶位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶高產(chǎn)突變菌株的快速篩選

為了快速鑒定纖維素酶高產(chǎn)菌株，我們將T-DNA隨機(jī)插入突變株與野生型菌株分別接種于篩選培養(yǎng)基(CMC-Na培養(yǎng)基)平板，篩選得到透明圈較野生型菌株顯著增大的突變株T53。野生型特異腐質(zhì)霉和T53菌株在含有羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)的篩選平板上生長(zhǎng)3天，剛果紅溶液染色后，CMC-Na水解區(qū)域清晰可見(jiàn)。T53與野生型菌株相比，氣生菌絲相對(duì)較多，并且T53所產(chǎn)生透明圈大小為0.8 cm，而野生型菌株透明圈大小為0.6 cm(圖1)。

2.2 T53菌株的酶活鑒定

為了進(jìn)一步鑒定特異腐質(zhì)霉野生型和T53菌株的纖維素酶表達(dá)分泌能力，我們將野生型菌株和T53進(jìn)行液體搖瓶發(fā)酵，并檢測(cè)發(fā)酵2～6天后,發(fā)酵上清中的各種纖維素酶活力。在整個(gè)發(fā)酵周期中，突變株T53發(fā)酵上清中的濾紙酶、內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和纖維二糖水解酶活力較野生型菌株均有了明顯提高，分別為野生型的1.4倍、1.6倍、1.9倍、1.1倍、1.6倍(圖2)。

圖1 T53和野生型(WT)特異腐質(zhì)霉菌株Y1的平板透明圈大小測(cè)定Fig.1 Plate-clearing zone assay of wild type(WT) H. insolens Y1 and T53.

蛋白電泳檢測(cè)發(fā)酵3～6天野生型菌株及T53發(fā)酵上清中的總分泌蛋白，結(jié)果顯示， T53突變菌株的蛋白分泌量較野生型菌株顯著提高，特別是40 kDa大小的蛋白表達(dá)量提高明顯(圖3)。

2.3 T53菌株中T-DNA插入位點(diǎn)的鑒定分析

為了揭示T53菌株中纖維素酶的高產(chǎn)分子機(jī)制，我們通過(guò)TAIL-PCR獲得T53中T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列。測(cè)序后與特異腐質(zhì)霉的基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定得到T53中的T-DNA插入位點(diǎn)。該位點(diǎn)位于一個(gè)功能未知基因(我們將其命名為HicelR1,GenBank Accession No.: MK468690)的上游啟動(dòng)子區(qū)域(ATG上游224 bp處，圖4)。該基因含有一個(gè)1 536 bp大小的開(kāi)放閱讀框，其編碼的氨基酸序列包含一個(gè)C2H2型鋅指簇DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)真菌特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域。我們推測(cè)該基因編碼了一個(gè)可能的鋅指蛋白類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。BlastP同源比對(duì)結(jié)果顯示，HicelR1與頂頭孢霉(Acremoniumchrysogenum)的Krueppel-like 因子[21]、馬杜拉足腫菌(Madurellamycetomatis)的金屬硫蛋白表達(dá)激活劑[22]、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子prz1[23]分別具有41%、49%、39%的序列一致性。

3 討論

特異腐質(zhì)霉可以產(chǎn)生豐富且性質(zhì)優(yōu)良的纖維素、半纖維素降解酶系[1～9]，并且具有作為表達(dá)宿主大量生產(chǎn)外源蛋白的能力[24]，因此是繼木霉、青霉和曲霉之后最有潛力的纖維素降解菌和絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)[25]。然而，迄今為止，關(guān)于特異腐質(zhì)霉中纖維素酶表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理以及纖維素酶高產(chǎn)分子機(jī)制的研究甚少。

圖2 T53與野生型特異腐質(zhì)霉菌株Y1不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)纖維素酶活力的比較Fig.2 Time course of cellulase activities of T53 and wild-type H. insolens Y1.

圖3 T53與野生型(WT)特異腐質(zhì)霉菌株Y1不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)蛋白分泌量的比較Fig.3 SDS-PAGE analysis of proteins secreted by T53 and wild type (WT) H. insolens Y1.

基于隨機(jī)插入誘變的遺傳篩選方法已廣泛應(yīng)用于多種生物的功能基因組研究中[26]。 在這項(xiàng)工作中，我們從實(shí)驗(yàn)室前期工作構(gòu)建的T-DNA隨機(jī)插入突變體庫(kù)中篩選得到一株纖維素降解能力

圖4 突變株T53中T-DNA插入位點(diǎn)示意圖Fig.4 Schematic diagram of T-DNA insertion site in mutant T53.

顯著提高的突變菌株T53。SDS-PAGE蛋白電泳顯示，T53菌株的胞外蛋白分泌量較野生型菌株顯著增多，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)前期工作的質(zhì)譜鑒定結(jié)果[18]，我們推測(cè)T53菌株纖維素降解能力的提高主要是由于纖維素酶Cel6A、Cel6B、Cel7A、Cel7B、CMC3和半纖維素酶XynA、XynB、XynC、Xyl43A和HIGAL表達(dá)分泌量的增加。上述纖維素酶和半纖維素酶的理論分子量，除XynB 外均集中在40 kDa左右(表1)，這也進(jìn)一步證實(shí)了突變株T53在40 kDa處較野生型明顯分泌增多的主要是纖維素酶和半纖維素酶類(lèi)(圖3)。

表1 特異腐質(zhì)霉纖維素酶和半纖維素酶的理論分子量Table 1 Theoretical molecular weight of cellulases and hemicelluloses of H. insolens.

與傳統(tǒng)物理、化學(xué)誘變方法相比，T-DNA插入突變的最大優(yōu)點(diǎn)在于便于對(duì)插入破壞的基因及其側(cè)翼序列進(jìn)行鑒定分析[26]。TAIL-PCR克隆得到T53菌株中的T-DNA插入位點(diǎn)，位于一個(gè)可能的真菌C2H2鋅指蛋白類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子編碼基因(命名為HicelR1)啟動(dòng)子區(qū)域。這表明，HicelR1很可能調(diào)控了特異腐質(zhì)霉中纖維素酶基因的表達(dá)。已有研究發(fā)現(xiàn)，HicelR1的同源蛋白參與了生物體的多種重要生命活動(dòng)，如人類(lèi)Krueppel-like因子參與了肺炎球菌感染期間抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-10的表達(dá)調(diào)控過(guò)程[31]、釀酒酵母金屬硫蛋白表達(dá)激活劑可以誘導(dǎo)金屬硫蛋白基因CUP1的轉(zhuǎn)錄[32]、裂殖酵母中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Prz1在質(zhì)膜鈣泵Pmc1的表達(dá)過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[33]，但尚未見(jiàn)其調(diào)控纖維素酶表達(dá)的報(bào)道。我們推測(cè)HicelR1很可能通過(guò)一種全局性調(diào)控模式參與了特異腐質(zhì)霉纖維素酶和半纖維素酶的表達(dá)調(diào)控。

突變株T53的篩選以及突變位點(diǎn)的鑒定研究，不僅為我們闡明突變菌株T53纖維素酶和半纖維素酶的產(chǎn)量提高的分子機(jī)理奠定了重要基礎(chǔ)，也為我們研究纖維素酶合成的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制提供了重要參考。這將進(jìn)一步豐富我們對(duì)木質(zhì)纖維素酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也為進(jìn)一步改良菌株和構(gòu)建高效的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)提供了重要的理論基礎(chǔ)。