陳澤歷, 楊林毅, 陳 潞, 孫 雁, 魏朝霞, 李永忠, 趙明富*, 文國松*

1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院, 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué), 農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室, 昆明 650201;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院, 昆明 650201

滇黃精(Polygonatumkingianum)是百合科(Liliaceae)黃精屬多年生草本藥用植物，以根莖入藥?！吨袊幍洹芬?guī)定滇黃精(Polygonatumkingianum)、黃精(Polygouatumsibiricum)、多花黃精(Polygouatumcyrtouema)為中藥黃精的3種基源植物，俗稱“大黃精”、“雞頭黃精”和“姜形黃精”，具有補益健脾、補氣潤肺、滋陰生津、補腎等功效[1]。野生滇黃精多生于林下、灌叢或陰濕草坡，有時生巖石上，主要分布于云南、四川、廣西、貴州等省區(qū)。滇黃精中含有多種有效成分:滇黃精多糖(Polygonatumkingianumpolysaccharide，PKP)具有降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)免疫等功效；總皂苷可改善學(xué)習(xí)記憶力、抗抑郁，也可調(diào)節(jié)血糖；黃酮類成分是黃精屬植物的特征性成分，總黃酮具有抗氧化活性[2,3]。臨床上常用滇黃精治療脾氣虧虛型血虛癥、貧血癥、高尿酸血癥、痛風(fēng)、頑固性咳嗽、小兒脾胃病以及男子不育癥等[4,5]。近年來，隨著對滇黃精研究的不斷深入，其應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展，市場需求量也相應(yīng)增加。野生滇黃精居群植株分布頻度已接近稀少或枯竭[6]，因而人工種植產(chǎn)業(yè)得到發(fā)展，但大面積單一種植易使滇黃精發(fā)生較為嚴重的病害。目前已報道的滇黃精病害，如葉斑病、炭疽病、黑斑病等真菌性病害，嚴重影響著其藥材產(chǎn)量和品質(zhì)[7]，但滇黃精病毒病未見報道。

菜豆普通花葉病毒(Beancommonmosaicvirus，BCMV)屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)成員，最早是從被侵染的菜豆植株中分離獲得的[8]，1934年P(guān)ierce[9]將其正式命名為BCMV。馬鈴薯Y病毒屬成員的病毒粒子呈線狀，大小為(680～900) nm×(11～13) nm[10]。BCMV基因組是1條全長約為9.6～10 kb的(+)ssRNA，結(jié)構(gòu)特征與典型的Potyvirus成員相同，5′端具病毒基因組連接蛋白(virus genome linked protein，VPg)，3′端具有Poly(A)尾，在5′-UTR和3′-UTR之間含有1個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼分子量約為350 kDa的具有蛋白酶活性的多聚蛋白，該多聚蛋白可被蛋白酶(P1、HC-Pro、NIa)切割產(chǎn)生10個成熟蛋白[11]。BCMV在全世界范圍內(nèi)均有分布，傳播途徑較多，主要經(jīng)蚜蟲非持久性傳播，還可通過機械接種、種子和花粉傳播。其寄主范圍廣泛，可侵染藜科、茄科、莧科、豆科、番杏科等9科44屬的約100多種植物[12,13]，感病組織細胞質(zhì)中可觀測到圓柱狀內(nèi)含體在組織橫切面呈風(fēng)輪狀結(jié)構(gòu)[12]，而植物受侵染后通常表現(xiàn)為花葉、葉片皺縮或變窄、植株矮化，豆科植物出現(xiàn)豆莢斑駁或畸形，造成嚴重的經(jīng)濟損失[14,15]。

在本課題組前期調(diào)查滇黃精病害過程中，發(fā)現(xiàn)田間部分滇黃精表現(xiàn)出明顯的花葉、葉片皺縮癥狀，與已報道的3種真菌性病害癥狀描述不同，而疑似病毒病，但此前未見BCMV侵染黃精屬植物的報道。因此，為了鑒定引起該癥狀的病原，本研究結(jié)合電鏡技術(shù)、血清學(xué)檢測技術(shù)和RT-PCR技術(shù)對云南文山出現(xiàn)花葉、皺縮癥狀的滇黃精病樣進行檢測和鑒定，以期為后續(xù)滇黃精病毒病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

病樣于2017年8月～9月采集自云南文山。在種植基地觀察到侵染癥狀的滇黃精，拍照并收集疑似病毒侵染的植株，以其為樣品進行病毒粒子提純觀察以及DAS-ELISA、RT-PCR檢測。DAS-ELISA檢測所用3份滇黃精病樣編號為DHJ1、DHJ2、DHJ3。

BCMV的ELISA試劑盒購自美國Creative Diagnostics公司，pGEM-TeasyPCR產(chǎn)物克隆試劑盒購自美國Promega公司，植物總RNA提取試劑盒、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、dNTPS、2×PowerTaqPCR Master Mix試劑盒等均購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，其他化學(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JEM-1200EXII透射電鏡(日本電子株式會社)；CCD相機(美國GATAN公司)；ABI PRISMTM 377 DNA自動測序儀測定(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.3 BCMV病毒粒子電鏡觀察

取呈現(xiàn)花葉、皺縮癥狀明顯的滇黃精病葉進行病毒粒子提純，提純參照Zhao等[16]的方法。提純的病毒粒子用浸出法在電子顯微鏡下觀察：用鋪有Formver膜的電鏡銅網(wǎng)沾取病毒粗提純液，用吸水紙吸干，加1滴2%磷鎢酸(pH 7.0)負染1 min，吸干，待干燥后用JEM-1200EXII透射電鏡觀察，并用GATAN CCD相機拍照。

1.4 血清學(xué)檢測

取呈現(xiàn)花葉、皺縮癥狀明顯的滇黃精病葉制樣進行血清學(xué)測定。向樣品中加入15倍體積的抽提緩沖液研磨，8 000 r/min離心5 min，取上清液作為待測樣品。血清學(xué)測定采用DAS-ELISA，用抗BCMV的抗體，檢測步驟按照BCMV ELISA Kit說明書進行。陽性對照來自于BCMV ELISA試劑盒，以健康滇黃精葉片為陰性對照，以緩沖液為空白對照。

1.5 病樣總RNA抽提和PCR擴增

病樣總RNA抽提采用離心柱型通用植物總RNA提取試劑盒，具體方法按說明書操作。PCR擴增引物為馬鈴薯Y病毒科特異性簡并引物(Sprimer/M4T)[16]。

抽提所得總RNA用于合成cDNA第一鏈，合成所用引物為M4T，總體系20 μL：總RNA 5 μL，引物M4T 1 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 1 μL，RNase Free ddH2O 7 μL，混勻后，于65℃溫育5 min，置于冰上急冷，再加入5×first-strand Buffer 4 μL，200 U/μL M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 1 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序為：30℃ 10 min，42℃ 60 min，95℃ 5 min，所得cDNA產(chǎn)物用于PCR擴增。隨后采用2×PowerTaqPCR Master Mix試劑盒，反應(yīng)體系參照說明書，反應(yīng)體系(50 μL)：2×PowerTaqPCR Master Mix 25 μL，上游引物(Sprimer)5 μL，下游引物(M4T)5 μL，模板 2 μL，ddH2O 13 μL。反應(yīng)程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，共30個循環(huán)；72℃ 10 min。最后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

1.6 克隆和序列分析

將PCR產(chǎn)物直接克隆到載體pGEM-T Easy vector[16]。采用ABI PRISMTM 377 DNA自動測序儀測定，序列分析采用DNAMAN和MEGA 7.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病概況及典型癥狀

為了明確引起滇黃精疑似病毒病癥狀的病原，本研究對云南文山種植基地的滇黃精進行病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)滇黃精病毒病大田發(fā)病率在9%～13%，正常植株葉片呈均勻的綠色、葉面平滑，植株健壯，而發(fā)病植株葉片呈花葉、皺縮癥狀，并且植株細弱(圖1)。

2.2 電鏡觀察病毒粒子形態(tài)

將呈花葉、皺縮癥狀明顯的滇黃精病葉提純病毒粒子后，提純的病毒粒子用浸出法在電子顯微鏡下觀察，可觀察到直線或彎曲線狀病毒粒子，大小為(670～760) nm×(9～12) nm(圖2)。而馬鈴薯Y病毒屬成員的病毒粒子也為線狀，由此推測滇黃精病樣中可能含有該屬病毒。

2.3 血清學(xué)檢測

取侵染癥狀明顯的滇黃精病葉，用抗BCMV的抗體進行DAS-ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)3份待測樣品的OD405值分別為1.542、1.633、1.598，空白對照和陰性對照的OD405值分別為0.09和0.102，陽性對照OD405值為1.472(表1)，結(jié)果表明DHJ1、DHJ2和DHJ3與抗BCMV的抗體呈強陽性反應(yīng)，可初步判定DHJ1、DHJ2和DHJ3可能含有BCMV。

圖1 滇黃精正常植株與田間自然發(fā)病植株Fig.1 Normal plant and plant naturally infected with BCMV of Polygonatum kingianum.

圖2 從滇黃精病樣提取的線狀病毒粒子Fig.2 Viral particles of BCMV purified from diseased leaves of Polygonatum kingianum.

2.4 PCR產(chǎn)物電泳檢測及測序分析

為了進一步確定經(jīng)ELISA檢測的滇黃精是否的確存在BCMV，取ELISA檢測呈陽性的病樣DHJ1，進行RT-PCR驗證。利用馬鈴薯Y病毒科屬簡并引物(Sprimer/M4T)進行擴增，結(jié)果擴增出大小約為1 700 bp的目的條帶。對目的條帶克隆并測序分析，結(jié)果表明，該PCR產(chǎn)物序列長為1 609 bp，包括部分NIb基因(588 bp)、CP基因(864 bp)和3′-UTR序列(157 bp)。在NIb蛋白的第30～32位存在保守基序GDD，推測NIb/CP裂解位點為VHLQ/SG(第193～198位)，CP氨基酸序列第208～210位存在與蚜傳密切相關(guān)的保守基序DAG(圖3)。滇黃精分離物，命名為BCMV-DHJ1，與已經(jīng)報道的BCMV湖北大豆分離物(KJ807813)、山東花生分離物(Laixi isolate，KF439722)、山東花生分離物(TA11 isolate，HM776124)、浙江花生分離物(AJ889245)核苷酸序列同源性為91%～99%，相應(yīng)區(qū)域NIb蛋白氨基酸序列同源性為99%～100%，CP氨基酸序列同源性為99%～100%(表2)。進一步分析菜豆普通花葉病毒滇黃精分離物BCMV-DHJ1與其他BCMV分離物的進化關(guān)系，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建該分離物和已報道的其他BCMV分離物CP氨基酸序列系統(tǒng)進化樹(圖4)，進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示BCMV-DHJ1與中國、美國、韓國、越南的分離物聚類為一簇，與花生(HM776124)和大豆(KJ807813)分離物親緣關(guān)系最近，CP氨基酸序列同源性為99%～100%。

表1 DAS-ELISA檢測結(jié)果Table 1 The detection results of DAS-ELISA.

表2 BCMV-DHJ1與其他BCMV分離物3′-端相應(yīng)區(qū)域核苷酸序列和CP基因編碼的蛋白氨基酸同源性比較Table 2 Comparisons of the 3′nucleotide sequences identity and animo acid sequences identity of CP among BCMV-DHJ1 and other BCMV isolates.

圖3 BCMV-DHJ1分離物基因組3′-末端相應(yīng)區(qū)域核苷酸及其編碼的氨基酸序列Fig.3 The nucleotides and putative amino acids of the 3′-end in BCMV-DHJ1 genome.

3 討論

根據(jù)不同Potyvirus屬成員的CP氨基酸同源性應(yīng)低于80%的分類標準，Potyvirus屬成員外殼蛋白核心區(qū)域的同源性低于65%時病毒分離物屬于不同種，同源性在72%～90%之間屬于同一病毒的不同分離物[17,18]。結(jié)合電鏡觀察到的病毒粒子形態(tài)以及DAS-ELISA檢測、病毒基因組3′-末端序列同源性分析和CP氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果，表明引起滇黃精花葉、皺縮癥狀的病毒病原為BCMV。這是首次報道BCMV自然侵染滇黃精，因此將該病毒命名為菜豆普通花葉病毒滇黃精Ⅰ號分離物(BCMV-DHJ1)。該結(jié)果可為滇黃精病毒病害的生物防治及健康種苗繁育提供理論基礎(chǔ)。

作為植物病毒檢測的常用方法，PCR檢測和ELISA檢測2種方法各有所長，不可相互替代，為避免實驗出現(xiàn)假陽性或者假陰性結(jié)果，2種方法要相互驗證，直到取得一致結(jié)果。本研究對葉片呈現(xiàn)花葉、皺縮癥狀的滇黃精樣品進行檢測，利用2種方法均驗證了BCMV的存在。

圖4 基于已報道的BCMV外殼蛋白(CP)氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹Fig.4 Phylogenetic trees based on CP amino acid sequences of the previously reported BCMV isolates.

BCMV為馬鈴薯Y病毒屬的重要成員，是豆科作物重要病毒之一，最早在美國報道[8]，在世界范圍內(nèi)都有分布[19]。BCMV除能侵染豆科外，還可侵染藜科、茄科和莧科等植物，給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟造成重大損失[13]。該病毒可經(jīng)桃蚜、棉蚜以非持久性方式傳毒，還可通過種子和花粉傳播[12]。馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus多聚蛋白可被病毒基因組編碼的3種蛋白酶(P1、HC-Pro、NIa)分解為10個較小的成熟蛋白，NIa-Pro蛋白酶負責(zé)切割多聚蛋白前體中-端的CI/6K2、NIa/NIb等多個酶切位點，裂解位點的識別模式均為V-X-X-Q(或E)-(A、S、G或V)，本研究中BCMV-DHJ1分離物氨基酸序列的NIb/CP裂解位點推測為VHLQ/SG，位于NIb蛋白第193～198位。Potyvirus成員的NIb蛋白從N端到C端含有GDD和GNNSGQPSTVVDNT等高度保守結(jié)構(gòu)域。在這一區(qū)域，高度保守的GDD基序如果發(fā)生突變，突變?yōu)锳DD后，依賴于RNA的RNA復(fù)制酶的酶活性降低，僅有野生型的7%。GDD保守區(qū)在結(jié)構(gòu)上類似于ATP和GTP結(jié)合酶類的B保守區(qū)NTP結(jié)合位點，是所有動物、植物以及細菌、病毒依賴于RNA的RNA聚合酶的特征性保守序列[20]。CP蛋白與RNA包裝、寄主范圍及蚜傳和癥狀誘導(dǎo)等功能有關(guān)，其N端的保守基序DAG與蚜傳研究比較多，如果保守基序DAG發(fā)生突變，病毒的蚜傳能力將受到影響，會部分或者全部喪失[21～25]。本研究中NIb蛋白的第30～32位存在保守基序GDD，CP蛋白第215～217位存在與蚜傳密切相關(guān)的保守基序DAG。因此，蚜蟲是否傳播BCMV-DHJ1以及哪種蚜蟲傳播值得深入研究，另外BCMV在滇黃精上是否種傳也有待研究。