李 楊 李明達(dá) 張毅方 江連洲 王中江 滕 飛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆分離蛋白(Soybean protein isolate, SPI)是指以低溫大豆粕為原料、采用堿溶酸沉方法制取的一種蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)90%的大豆蛋白制品。為了改善大豆分離蛋白的功能特性，提高其生物利用率，同時除去某些有害物質(zhì)，常通過物理改性、化學(xué)改性、酶改性等方式對大豆分離蛋白進(jìn)行修飾。其中，高壓均質(zhì)處理是食品加工中應(yīng)用最為普遍的一種物理改性方式，且其對大豆蛋白功能性質(zhì)的影響已被廣泛研究。高壓均質(zhì)處理過程中的空化、剪切、湍流和溫度上升等同時作用，使蛋白分子之間的非共價鍵斷裂，產(chǎn)生分子間或分子內(nèi)的重聚集，破壞分子間的疏水作用和靜電吸引作用，改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)[1]。翟愛華等[2]研究了40 MPa下高壓均質(zhì)處理對大豆蛋白7S和11S乳化性和溶解性的影響，結(jié)果表明，處理后溶解性和乳化性均增大。楊盛楠等[3]研究發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白經(jīng)過0～55 MPa的均質(zhì)處理，溶解性和乳化性也表現(xiàn)出增大的趨勢，但對其相關(guān)性未做進(jìn)一步研究。YANG等[4]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過207 MPa壓力處理的蠶豆蛋白，其溶解性明顯改善，但乳化性卻有所降低。YU等[5]研究發(fā)現(xiàn)，貽貝肌原纖維蛋白經(jīng)過0～100 MPa均質(zhì)壓力處理后，乳化性和溶解性顯著提高，二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。目前有很多學(xué)者對高壓均質(zhì)處理大豆分離蛋白的溶解性和乳化性進(jìn)行研究，并發(fā)現(xiàn)其存在一定相關(guān)性，但沒有關(guān)于低壓均質(zhì)處理(0～40 MPa)對大豆分離蛋白的溶解性和乳化性的相關(guān)性及其結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道。

實(shí)際生產(chǎn)中，由于受設(shè)備的限制，均質(zhì)處理的壓力一般不超過40 MPa。本文研究低壓均質(zhì)(0～40 MPa)對大豆分離蛋白溶解性及其結(jié)構(gòu)的影響，并從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化出發(fā)，探討其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕，哈高科大豆食品有限責(zé)任公司；一級大豆色拉油，九三集團(tuán)哈爾濱惠康食品有限公司；氫氧化鈉、鹽酸等為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1C型冷凍干燥機(jī)， 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；FJ-200型高速分散均質(zhì)機(jī)， 上海標(biāo)本模型廠；實(shí)驗(yàn)型高壓均質(zhì)機(jī)，英國Stansted Fluid Power公司； LGR20-W型臺式高速冷凍離心機(jī)， 北京京立離心機(jī)有限公司；PALS型激光粒度分析儀， 美國布魯克海文儀器公司；F-4500型熒光分光光度計(jì)， 日本HITACHI公司；Netzsch-DSC 204-F型差示掃描量熱儀(Differential scanning calorimetry，DSC)， 德國Netzsch公司。

1.3 方法

1.3.1SPI制備

稱取1 600 g脫脂豆粕，分散在12 L去離子水中，用2 mol/L的NaOH調(diào)pH值至7.5，在55℃下攪拌1 h，離心(4 500 r/min，20 min)取上清液；在沉淀中加入9.6 L去離子水?dāng)嚢璨⒅貜?fù)上述離心操作，取上清液。將兩次上清液合并，在水浴50℃下，調(diào)pH值至4.5，離心(3 000 r/min，10 min)取沉淀，即為蛋白凝乳，加少量水洗滌3次后調(diào)pH值至7.0，配成11%的SPI溶液，分為5份，分別在壓力10、20、30、40 MPa下均質(zhì)改性，與對照樣品一起冷凍干燥，貯存。

1.3.2粒度測定

參照張媛等[6]的測定方法，采用激光粒度分析儀測定SPI的粒徑分布。用50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值 7.0)將SPI樣品稀釋為1 mg/mL的蛋白溶液，于室溫(20℃)條件下進(jìn)行測量。

1.3.3溶解性測定

參照王辰等[7]的測定方法，稱取100 mg SPI樣品分散于10 mL去離子水中，磁力攪拌30 min，20℃、12 000g離心20 min。上清液經(jīng)適度稀釋，采用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)的溶解度表示為上清液蛋白質(zhì)量濃度占總蛋白質(zhì)量濃度的百分比。

1.3.4乳化活性及乳化穩(wěn)定性測定

參照TANG等[8]的方法，測定SPI的乳化活性指數(shù)(Emulsifying activity index，EAI)和乳化穩(wěn)定指數(shù)(Emulsion stability index，ESI)。將處理后的SPI樣品稀釋到2 mg/mL，處理后SPI樣品與大豆油以體積比3∶1混合，以10 000 r/min高速乳化1 min，迅速吸取底部乳液50 μL加入到5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液中，在漩渦混合器上混合均勻。分別測定0 min和10 min吸光度，檢測波長500 nm下的吸光度，計(jì)算公式為

(1)

(2)

式中EAI——乳化活性指數(shù)，m2/g

ESI——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，%

T——反應(yīng)速率常數(shù)，取2.303

V——稀釋倍數(shù)

A0——零時刻的吸光度

A10——靜止10 min的吸光度

C——蛋白質(zhì)量濃度，g/mL

Φ——乳化液中油的體積分?jǐn)?shù),%

1.3.5熒光光譜測定

參照唐傳核等[9]的方法，低壓均質(zhì)的SPI內(nèi)源性熒光光譜(色氨酸熒光光譜)采用F-4500型熒光分光光度計(jì)測定。將SPI樣品用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值為7.0)配制成質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL的蛋白溶液。SPI內(nèi)部的色氨酸基團(tuán)為熒光探針分析熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長設(shè)定為290 nm，發(fā)射波長掃描范圍為300～400 nm，激發(fā)狹縫寬度為5 nm，同樣發(fā)射狹縫寬度也為5 nm。重復(fù)掃描3次。

1.3.6三維熒光光譜測定

參照ZHANG等[10]的方法，采用熒光光譜儀將不同低壓均質(zhì)處理?xiàng)l件下的SPI樣品，用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值為7.0)配制成質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL的蛋白溶液。激發(fā)波長掃描范圍為200～350 nm，發(fā)射波長掃描范圍為200～500 nm，激發(fā)狹縫寬度為10 nm，同樣發(fā)射狹縫寬度也為10 nm，重復(fù)掃描3次。

1.3.7DSC測定

參照王中江等[11]的方法，稱取不同低壓均質(zhì)處理?xiàng)l件下SPI樣品5 mg與10 μL的0.01 mol/L磷酸緩沖溶液(pH值為7.0)混合放入鋁盒中，壓盤密封，室溫條件下放置8 h。將經(jīng)過平衡處理的樣品鋁盒放入到DSC操作臺左側(cè)，空白鋁盒放置在右側(cè)。以10℃/min升溫速率在20～110℃范圍內(nèi)掃描。將此過程中記錄SPI的變性溫度(TD)和變性焓變(ΔH)。重復(fù)測定3次取平均值以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

1.3.8統(tǒng)計(jì)分析

圖表制作采用OriginPro 8.5軟件，使用SPSS 19.0進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析和方差分析(P<0.05為顯著性差異)。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 粒徑分布

近年來，激光光散射技術(shù)廣泛應(yīng)用于高分子和膠體科學(xué)研究中，包括靜態(tài)(經(jīng)典)和動態(tài)兩部分。本文應(yīng)用動態(tài)光散射技術(shù)表征SPI在不同均質(zhì)壓力條件下的溶液行為。

圖1 低壓均質(zhì)對大豆分離蛋白粒徑分布的影響Fig.1 Effect of low pressure homogenization on particle size distribution of SPI

由圖1可知，均質(zhì)壓力由0 MPa增大至30 MPa時，SPI溶液的粒徑分布逐漸向小粒徑方向移動，主要分布在50～1 000 μm之間。畢爽等[12]研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白-磷脂酰膽堿復(fù)合體系經(jīng)過高壓均質(zhì)機(jī)后在狹小的空間內(nèi)被撞擊，造成復(fù)合體系顆粒的解聚、破碎，所以粒徑較小。而當(dāng)均質(zhì)壓力達(dá)到40 MPa時，大豆分離蛋白的粒徑分布則表現(xiàn)出向右平移的趨勢，主要分布在100～1 000 μm之間。這可能是均質(zhì)壓力進(jìn)一步增大時，大豆分離蛋白分子之間相互作用加強(qiáng)，促進(jìn)了蛋白質(zhì)聚集體的形成，從而使平均粒徑有所提高。YU等[5]得出了相似的結(jié)果，貽貝肌原纖維蛋白的粒徑分布寬度隨著均質(zhì)壓力的增大而減小，但100 MPa下發(fā)現(xiàn)更寬的粒徑分布，推測可能是形成了更大的聚集體。

2.2 溶解度

由圖2可知，未經(jīng)均質(zhì)處理的樣品溶解度為46.8%，隨著均質(zhì)壓力的逐漸增大，溶解度逐漸增大， 30 MPa時，相對于未處理樣品，溶解度提高了11個百分點(diǎn)，這主要是由于低壓均質(zhì)過程中，SPI受到剪切力和沖擊力作用，粒徑降低，比表面積增大，增大了蛋白與水的接觸面積，水溶性得到提高。與文獻(xiàn)[13-15]的結(jié)論一致，即粒徑減小時，蛋白質(zhì)分子的表面區(qū)域變大，分子活性基團(tuán)暴露，其通過氫鍵與水相互作用從而提高了溶解度。姜梅等[16]的研究則認(rèn)為高壓均質(zhì)使得大豆蛋白的緊密結(jié)構(gòu)逐漸展開，使得球狀蛋白質(zhì)內(nèi)部的極性基團(tuán)和疏水基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)分子(顆粒)的表面電荷分布加強(qiáng)，圍繞著新暴露的極性基團(tuán)的結(jié)合水也增多，蛋白質(zhì)的水化作用增強(qiáng)，進(jìn)一步提高溶解性。

圖2 低壓均質(zhì)對大豆分離蛋白溶解度的影響Fig.2 Effects of low pressure homogenization on solubility of SPI

而當(dāng)均質(zhì)壓力為40 MPa時，SPI的溶解度有所降低，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是蛋白質(zhì)分子在解折疊的過程中，更快速的剪切力和撞擊作用使得展開的分子之間發(fā)生強(qiáng)的靜電引力而產(chǎn)生部分聚集，從而降低了SPI在水中的溶解性[17]。

2.3 乳化活性及乳化穩(wěn)定性

乳化性是指蛋白質(zhì)導(dǎo)致油與水混合，形成乳化液，并使其保持穩(wěn)定，包括乳化活性和乳化穩(wěn)定性。由圖3可知，SPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均隨著均質(zhì)壓力的升高而呈先增大后降低的趨勢。30 MPa時，SPI的乳化活性指數(shù)達(dá)到49.5 m2/g，比未處理樣品提高了8.3 m2/g。這可能是由于隨著均質(zhì)壓力增大，大分子蛋白受到的剪切作用增強(qiáng)，使得分子平均粒徑降低，更多的極性基團(tuán)吸附到油水界面，從而改善乳化活性和乳化穩(wěn)定性。郭麗等[18]得出了相似的結(jié)論，即蛋白質(zhì)分子經(jīng)過均質(zhì)處理后在水中進(jìn)一步伸展，極性側(cè)鏈基團(tuán)的水合作用增強(qiáng)，親水性提高，同時聚集在油-水界面，降低其表面張力，進(jìn)一步提高乳化活性。文獻(xiàn)[19-20]的研究也證實(shí)上述結(jié)論。而當(dāng)壓力繼續(xù)增大到40 MPa時，乳化性反而降低，可能是由于均質(zhì)壓力的增大進(jìn)一步降低了蛋白分子粒徑，反而提高了分子間的靜電引力，從而導(dǎo)致溶解性降低，乳化性也隨之降低。LIU等[21]研究發(fā)現(xiàn)，高壓均質(zhì)對乳清蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性具有負(fù)面影響，這可能與界面膜的粘彈性部分降低有關(guān)，也可能與可溶性超分子聚集體引起的絮凝效應(yīng)有關(guān)。

圖3 低壓均質(zhì)對大豆分離蛋白乳化性的影響Fig.3 Effects of low pressure homogenization on emulsifying of SPI

2.4 蛋白溶解性和乳化性的相關(guān)性分析

由圖4、5可知，隨著溶解度的增加，乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)均呈遞增趨勢，具有良好的線性相關(guān)關(guān)系，其中，SPI的溶解度與乳化活性指數(shù)、乳化穩(wěn)定性指數(shù)的線性擬合模型函數(shù)分別為y=0.788 8x+4.863 6、y=0.561 4x-13.373，相關(guān)系數(shù)分別為0.956 8、0.962 5。當(dāng)均質(zhì)壓力為30 MPa 時，SPI的溶解性與乳化性達(dá)到最強(qiáng)，并且低壓均質(zhì)處理通過改變蛋白的溶解性，進(jìn)而影響乳化性和乳化穩(wěn)定性。

圖4 大豆分離蛋白溶解性和乳化活性的關(guān)系Fig.4 Relationship between solubility and emulsification of SPI

圖5 大豆分離蛋白溶解性和乳化穩(wěn)定性的關(guān)系Fig.5 Relationship between solubility and emulsification stability of SPI

2.5 熒光光譜分析

熒光光譜是分析蛋白質(zhì)三級局部結(jié)構(gòu)的有效方法。本文采用290 nm作為激發(fā)波長，所得圖譜主要是以色氨酸(Try)為發(fā)射基團(tuán)的熒光光譜，表征色氨酸微環(huán)境極性的變化，是一種在三級結(jié)構(gòu)水平反映蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的比較靈敏的技術(shù)手段。

由圖6可知，隨著均質(zhì)壓力的增大，SPI的最大發(fā)射波長紅移，熒光強(qiáng)度隨著均質(zhì)壓力的增大而升高，當(dāng)均質(zhì)壓力為30 MPa時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大?？赡苁荢PI在低壓均質(zhì)作用下發(fā)生了部分結(jié)構(gòu)解折疊，內(nèi)部疏水性基團(tuán)逐漸暴露，更多的Try殘基暴露于蛋白質(zhì)分子表面，熒光強(qiáng)度增大；王喜波等[22]研究表明，隨著均質(zhì)壓力的增加，SPI 空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，Try殘基暴露于蛋白質(zhì)分子表面，蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域局部改變，發(fā)色基團(tuán)如色氨酸殘基所處環(huán)境由非極性向極性轉(zhuǎn)化，這可能是高壓均質(zhì)處理導(dǎo)致SPI蛋白分子部分解折疊造成的，即隨著柔性的增加，SPI 三級結(jié)構(gòu)變得更加舒展。當(dāng)均質(zhì)壓力為40 MPa時，最大發(fā)射波長發(fā)生藍(lán)移，熒光強(qiáng)度有所降低，這可能與蛋白質(zhì)在此狀態(tài)下發(fā)生的亞基重聚集行為有關(guān)。YU等[5]研究了蠶豆蛋白隨著壓力的增加，發(fā)射峰的強(qiáng)度逐漸降低。最大發(fā)射波長藍(lán)移，表明蠶豆蛋白的芳香族氨基酸殘基從疏水環(huán)境轉(zhuǎn)移到更親水的環(huán)境中，與上述結(jié)果不同，可能是由于后者的均質(zhì)壓力更高，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化有所差異。

圖6 不同均質(zhì)壓力下大豆分離蛋白熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectra of SPI under different homogenization pressures

2.6 三維熒光光譜分析

三維熒光光譜是解析蛋白結(jié)構(gòu)特征的重要方式之一。圖7a～7e分別表示經(jīng)過0～40 MPa均質(zhì)處理的SPI的三維熒光譜。圖中，峰a為瑞利一級散射峰，峰b為二級散射峰。經(jīng)過均質(zhì)處理后的SPI，光散射作用增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度增大。圖中峰1表示色氨酸和酪氨酸產(chǎn)生的特征峰[23]，經(jīng)過均質(zhì)處理后，峰1的顏色變淺，顏色越淺表示熒光強(qiáng)度越低，表明SPI經(jīng)過低壓均質(zhì)壓力處理后，熒光強(qiáng)度顯著降低，等高線變稀疏，可能是由于更多的酪氨酸和色氨酸殘基包埋于蛋白的疏水區(qū)域中。峰2表示多肽鏈骨架結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的特征峰[24]，隨著均質(zhì)壓力升高，此區(qū)域面積減少，表示均質(zhì)處理使得蛋白質(zhì)多肽鏈的骨架伸展，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；當(dāng)均質(zhì)壓力達(dá)到40 MPa時，峰2所在區(qū)域的面積有所增大，側(cè)面證明了蛋白聚集體的形成。

2.7 DSC分析

差示掃描量熱法(DSC)是用于測量樣品熱力學(xué)特性的一種熱分析技術(shù)，具有分辨能力強(qiáng)、靈敏度高、用料少等特點(diǎn)，被大量應(yīng)用于蛋白質(zhì)熱變性研究領(lǐng)域。在DSC譜圖中，通過最大峰對應(yīng)的溫度和峰面積可分別確定變性溫度(TD)及焓變(ΔH)。變性溫度代表蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，而焓變則反映蛋白質(zhì)分子的疏水性和/或親水性，同時也反映蛋白質(zhì)分子的聚集程度[25]。

圖7 低壓均質(zhì)處理大豆分離蛋白的三維熒光光譜Fig.7 Three-dimensional fluorescence spectrum analysis diagrams of SPI treated by low pressure homogenization

如表1所示，不同均質(zhì)條件處理后大豆蛋白的峰形相似，均有兩個變性峰，即為SPI中兩種主要的蛋白：β-伴球蛋白(7S)和球蛋白(11S)。未經(jīng)處理的SPI的7S和11S的變性溫度分別為76.87℃和96.18℃。與對照樣品相比，經(jīng)10～30 MPa均質(zhì)處理后SPI的變性溫度得到一定程度的降低，這表明均質(zhì)處理改變了SPI的空間構(gòu)象，但當(dāng)均質(zhì)壓力繼續(xù)升高至40 MPa時，7S和11S的變性溫度均表現(xiàn)出上升趨勢，F(xiàn)LOURY等[26]的研究表明，高壓均質(zhì)可使大豆蛋白的變性溫度升高，加大了大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。文獻(xiàn)[27-28]也表明高壓均質(zhì)可使天然蛋白質(zhì)變性并產(chǎn)生緊密的內(nèi)部結(jié)構(gòu)以增強(qiáng)熱穩(wěn)定性。上述結(jié)論證明均質(zhì)壓力40 MPa下，部分解離的7S、11S組分重新結(jié)合形成更穩(wěn)定聚集體。

表1 低壓均質(zhì)處理后大豆分離蛋白的DSC分析Tab.1 DSC analysis of SPI after low pressure homogeneous treatment

注：同一列中不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。

焓變可以評定蛋白質(zhì)的變性程度，焓變越小，則表示其變性越大，相反，焓變越大，表明變性越小。ZHOU等[29]研究發(fā)現(xiàn)焓變的降低表明蛋白質(zhì)中有序結(jié)構(gòu)的減少，CHEN等[30]認(rèn)為高壓均質(zhì)對蛋白內(nèi)部和分子間疏水鍵有破壞作用，使其暴露于分子表面，因此蛋白結(jié)構(gòu)中完全熱解折疊所需的能量減少，從而焓變降低。由上述結(jié)論可得，均質(zhì)壓力為30 MPa時，焓變最小，說明SPI的變性程度較大，影響其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而改善溶解性和乳化性。這與之前熒光光譜擬合的大豆蛋白三級結(jié)構(gòu)的變化相吻合。

3 結(jié)束語

低壓均質(zhì)處理對SPI的粒徑分布、溶解性、乳化活性、乳化穩(wěn)定性、三級結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性均產(chǎn)生了顯著的影響，尤其是在30 MPa時，溶解性和乳化性均取得最大值。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：SPI的溶解度與乳化活性指數(shù)、乳化穩(wěn)定性指數(shù)具有正相關(guān)性，其線性擬合模型函數(shù)分別為y=0.788 8x+4.863 6、y=0.561 4x-13.373，相關(guān)系數(shù)分別為0.956 8、0.962 5。此時，蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)展開，變性程度最大。熒光光譜結(jié)果表明，隨著均質(zhì)壓力的增大，SPI結(jié)構(gòu)展開，色氨酸基團(tuán)暴露，熒光強(qiáng)度增大，40 MPa時，蛋白分子可能發(fā)生亞基聚集，疏水基團(tuán)內(nèi)卷，從而使熒光強(qiáng)度降低。DSC的結(jié)果表明，隨著均質(zhì)壓力的增大，變性溫度和焓變降低，SPI中的有序結(jié)構(gòu)減少，表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散；當(dāng)均質(zhì)壓力增大到40 MPa時，由于形成蛋白聚集體，提高了分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，充分驗(yàn)證了熒光光譜擬合的大豆蛋白三級結(jié)構(gòu)變化。